乙型肝炎病毒基因分型技術的研究綜述

王麟 鄭敏

【摘 要】 目前國內外對乙型肝炎病毒的不斷研究發現，乙型肝炎病毒基因型分布存在地理差異與肝病的發生、發展以及抗病毒藥物的療效都有一定的相關性。本文針對乙型肝炎病毒（HBV）生物學特征和流行病學特點對當前各種HBV基因型分型技術方法的優缺點等相關研究進行綜述。

【關鍵詞】 乙型肝炎病毒；基因分型技術；綜述

【中圖分類號】

R446.61 【文獻標志碼】

A 【文章編號】1005-0019（2019）07-285-01

乙型病毒性肝炎是感染了乙型肝炎病毒（HBV）后引發的一種疾病。其中HBV病毒作為一種嗜肝病毒，對于人體的肝細胞會造成比較大的損害，引發肝細胞炎癥、壞死跟纖維化，并會直接危及到患者的生命健康安全。乙型病毒性肝炎作為全球范圍內的一種傳染病疾病，目前已經有超過20億人感染過HBV，每年也越有60萬人因為慢性或者急性乙型肝炎而死亡，我國是乙肝病毒感染大國，每年新發病人約有900萬人。近年來，隨著分子生物技術迅猛發展，人們對HBV認識的不斷深入，通過對HBV基因分型，有利于更加深入細致地對HBV感染的流行病學、病因學及臨床診治研究。

1 乙型肝炎病毒生物學特征

據研究，HBV屬嗜肝DNA 病毒科，其核酸為部分雙鏈閉合環狀DNA。由一條較長且長度固定的負鏈和一條短的長度不定的正鏈組成，是目前己知感染人類最小的DNA病毒。長鏈稱為負鏈，它攜帶有病毒全部的編碼信息；短鏈稱為正鏈，大約是負鏈的50%-100%.大約有3182-3221個核苷酸組成病毒基因組。其中HBV DNA負鏈劃分為4個開放讀碼框（ORF），即⑴S-ORF是乙肝表面抗原（S）所在部位，由S、Pre-S1和Pre-S2 3個區域組成，編碼大、中、小3種胞膜蛋白；⑵C-ORF分為pre-C和C區是病毒感染性的決定部位，編碼HBeAg和HbcAg曲段具備有高免疫原性，也是免疫攻擊靶標的位置；⑶P-ORF 是最長的閱讀框和S-ORF、C-ORF、X-ORF重疊，是P蛋白（即HBV-DNA多聚酶）病毒復制的主要功能單位；⑷X-ORF編碼HBx蛋白作為一種多功能反式調節因素，還有著增強子跟啟動子兩者的轉錄功能，與HBV感染導致的肝細胞癌變密切相關。

2 HBV基因型的分子流行病學

HBV基因型有著一定的地理區域性特點，在不同區域中的流行以及傳播方式也有著比較大的差異。因此在進行HBV自然感染史發生跟變異特點的研究過程中，也就可以通過不同地區優勢基因型來進行，對于南亞及琉球群島等地區的BBV主要基因型分布情況進行分析，結果見表1。

3 HBV基因型對抗病毒藥物使用的影響

抗病毒治療的成效既于感染者自身免疫情況有關，也于病毒基因型有關。HBV的各基因區及多數調控序列中都可發生變異，HBV基因突變會產生病毒耐藥。臨床上經常有因為不同區域的HBV變異所導致的免疫逃逸性跟致病性等問題出現，對于乙肝患者的診斷、治療跟防治工作也造成了比較大的阻礙。現階段多是采用干擾素跟核苷酸類似物來進行慢性乙型肝炎的治療，臨床應用的主要有拉米夫定、阿德福韋、恩替卡韋、替比夫定。拉米夫定耐藥機制為HBV-DNA聚合酶基因突變引起病毒DNA與藥物結合力減弱突變部位有：rtM204I，rtM180M+rtM204V，rtL180M+rtM204I，rtV173L+rtL180M+rtM204V，其中最常見變異是rtM204V/I。阿德福韋是開鏈核苷酸類似物其耐藥位點是HBV聚合酶P區的rtA181T/V和rtN236T，其中rtN236T的變異較常見。恩替卡韋的變異位點在HBV聚合酶P區的rtT184G，rtS202I或rtM250V，其耐藥的機制可能是限制了恩替卡韋與HBV多聚酶的結合。替比夫定是較新上市的核苷類抗病毒藥物，屬于左旋核苷類似物，具有較拉米夫定更強的抑制HBV的活性，且耐藥發生率低，治療1年時僅5%出現變異。對于部分長期服用核苷酸類藥物的患者，還要做好基因型跟耐藥突變位置的檢測工作，來對不同基因型乙肝患者的耐藥基因進行分析，并在此基礎上進行抗病毒藥物的針對性選擇。

4 HBV基因型分型技術的研究和發展

4.1 HBV全基因測序分型法 通過PCR擴增HBV全基因DNA的方式，可以實現HBV的全基因測序，對于不同病毒株親緣關系以及型別的確定也有著積極意義。利用以網絡為基礎的HBV基因分型處理工具，只需要輸入待分析序列就能夠查詢到結果，并且有著操作簡單、信息量跟可靠性高的應用優勢。但是該測序方法的成本比較多，耗費時間長而且敏感度有限，不宜進行大量標本的流行病學研究。

4.2 PCR-限制性片段長度多態性（RFLP）基因分型法 PCR-RFLP技術主要是PCR跟RFLP兩種技術的結合，在該測序技術中能夠使用來源于RCP擴增目的片段在合適的限制性內切酶水解作用中，采用瓊脂糖凝膠電泳來進行處理，讓其在不同基因型片段中呈現出不同的條帶加以區分，該分型方法比較簡便有效，還不需要對酶切產物進行雜交跟測序處理，因此在流行病調查研究工作中獲得了良好的應用效果。但是該分型方式只能夠對限制酶序列內的圖片進行識別，若限制酶的消化待測序列不切地或者遇到混合基因型的復雜條帶時，也就難以獲得良好的分型識別效果，此外還存在有參考序列過少以及圖譜復雜程度高的特征。

4.3 線性探針反向雜交基因分型法 此法是比利時Innogenetics公司發明，首先需要結合待測序列來進行特異性線性探針的設計，隨后將其固化在支持物上面進行PCR擴增處理，隨后將擴增產物跟固相探針進行反向雜交處理，顯色處理后就能夠獲得分型結果。此法可檢測單型感染也可檢測多型混合感染，是一種可信、便利、快速的方法。缺點是只能對已建立的基因型進行分型。

4.4 酶免疫測定基因型分型法（ELISA） 用辣根氧化物酶標記對乙肝病毒前S2區（b、k、m、s、u、f、g）進行特異性單克隆抗體的設計。應用雙抗夾心法來進行檢測時，可以通過跟待測標本進行表位組合的模式來進行基因型的鑒定工作。該分型法操作簡便，能夠在大樣本檢測中獲得良好的檢測效果。但是缺點是必須是HBV表面抗原陽性血清，對于混合型感染跟HBV表面抗原低水平表達的標本也難以進行有效鑒別。此外構建抗前S2基因特異性表位的單克隆抗體還有著一定的難度，而且b、k、m、s和u表位有相應基因型進行充分的表達，但是f跟g表位在一些基因型上面還有著表達不充分的問題，因此在診斷過程中存在有一定的漏檢情況。

4.5 多重特異性引物PCR基因分型法 對HBV中的各型全序列以及目標序列，隨后找出每種基因型相對于其它各型的獨特序列，在此基礎上進行針對各基因型獨特引物的合理設計。通過HBV基因型特異物對待測標本進行PCR擴增處理，采用瓊脂糖凝膠電泳進行標本鑒別處理。作為一種簡單、快速以及高特異性的分型方法，HBV基因型特異性引物PCR分型法在臨床診斷以及大規模流行病學中也能夠獲得良好的應用效果。缺點是單核苷酸多態性（SNP）酶切點可影響方法靈敏度，且檢測中有2.9%-4.5%的檢測不確定性。

4.6 反向斑點雜交基因分型法 此法是Saiki等提出的一種斑點雜交技術，該技術主要是針對各等位基因的特異性特診，在雜交基質上進行探針點的添加，隨后將標本跟待測DNA樣品進行雜交處理，這樣才能夠實現待測樣本跟互補序列探針的有效結合。在對未結合的DNA進行洗滌之后，對于特異性結合靶序列中的基因分型方法有著良好的檢測效果。該辦法有著快速簡便、敏感度高以及特異性強的應用優勢，在基因分型、基因突變檢測以及病原體檢測等多個方面也有著良好的應用優勢。缺點是可能會因基因組探針結合位點的多態性或缺失影響靈敏度。

4.7 核酸微孔芯片雜交基因分型法 是由Song等發明了一種可以檢測A-G型的低密度的核酸微孔芯片。先將病毒核酸的前S區進行PCR擴增并進行標記。擴增后，加入到已固定型特異探針的硅烷化的玻片上，再與進化樹及前S序列比對。用掃描設備檢測相應的熒光信號的基因分型法。此法檢測單型或混型感染的樣本均有著不錯的特異性和靈敏度。缺點是費用昂貴，因基因組探針結合位點的多態性或缺失影響靈敏度。

4.8 實時熒光定量PCR-解離曲線基因分型法 將傳統PCR擴增和檢測結合，在同一個密閉容器中將PCR擴增反應與熒光標記探針結合在一起，檢測目的核酸稱為“實時”PCR，當PCR擴增結束后，通過分析PCR擴增產物變化曲線進行分型。實時熒光定量PCR-解離曲線技術能在很大程度上避免交叉污染，具備省時、高通量、高靈敏度等優點，也可檢測混合型基因感染。缺點是對PCR儀器性能要求較高且具有多色熒光的干擾；需完成多個型特異的PCR反應；會因基因組引物、探針結合位點的多態性或缺失影響靈敏度。

5 HBV基因分型技術的應用與展望

目前越來越多的研究表明，HBV基因型呈現明顯的域分布差異，大規模的系統流行病學分子特征普查將更有助于人們認識不同基因型間的不同致病性對疾病演變、傳播方法和HBV與機體以及藥物的辯證關系，對指導抗病毒治療有著重要的意義。這依賴于簡便快速的HBV基因分型方法。當前HBV基因分類方法尚不完善，HBV基因型分類存在很多復雜因素。相信隨著分子生物學技術的發展，通過不斷探索研究，將會把HBV基因分型技術運用到HBV臨床類型檢測、預后判斷及治療方法中，實現真正個體化用藥。

參考文獻

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