HOXB9在乳腺癌中的表達及其對預后的意義

朱夢柳,潘婷婷,馬小鵬,鄧福生

(安徽醫科大學附屬省立醫院普外科，合肥 230001)

盡管乳腺癌患者的治療和總體預后已經得到了改善，但乳腺癌仍然是全世界女性最常見的癌癥之一[1]。其臨床病理因素如腫瘤大小、腋窩情況、淋巴結轉移情況、病理分級和激素受體水平是乳腺癌治療的主要影響因素[2]。近年來，多項研究報道HOXB9與多種惡性腫瘤的增殖、遷移和侵襲能力密切相關，如前列腺癌[3-4]、膀胱癌和甲狀腺癌[5-7]、結腸癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]等。然而，HOXB9在乳腺癌患者中的預后價值及其生物學功能尚不清楚。基于該領域研究的不足，本研究首次通過檢測HOXB9 在乳腺癌組織中的表達，分析其表達水平與乳腺癌臨床病理特征和預后的關系，探討其在乳腺癌中的潛在臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2009年1月至2013年12月在本院乳腺外科行乳腺癌手術的133例乳腺癌石蠟標本進行免疫組織化學實驗。通過Western blot方法檢測20例乳腺改良根治術切除的新鮮乳腺癌組織及其對應的癌旁組織(離腫瘤邊緣2 cm)中HOXB9蛋白的表達水平。收集每位患者的臨床病理數據,例如,年齡、雌激素受體(ER)表達水平、孕激素受體(PR)表達水平、人類表皮生長因子受體(HER2)表達水平、增殖細胞核抗原(ki-67)表達水平、腫瘤大小、淋巴結轉移情況、分子分型(Luminal-A、Luminal-B、HER2過表達、三陰型)等相關資料。本研究得到了每位患者的知情同意，并得到了本院臨床實驗室倫理委員會的批準。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學 采用免疫組織化學染色SP法檢測人乳腺癌術后標本中乳腺癌組織及其對應的癌旁組織HOXB9的表達部位及強度。操作步驟：4 μm切片，60 ℃烤片過夜；常規脫蠟水化，水洗；高溫、高壓修復5 min；滴加一抗4 ℃過夜；滴加二抗；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液37 ℃孵育20 min；二氨基聯苯胺(DAB)顯色；蘇木素復染；顯微鏡觀察；圖像分析。HOXB9表達的免疫反應性由本院的2名病理學專家獨立評估。免疫組織化學一抗為美國Molecular Tag公司原裝進口；多聚賴氨酸、二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自鎮江厚普生物科技有限公司。

1.2.2Western blot 在術后新鮮腫瘤組織和對應的癌旁組織進行取材，將組織剪碎，使用細胞裂解液提取蛋白。用蛋白質定量試劑盒(BCA)法進行蛋白水平測定。取75～100 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，后轉移至硝基纖維素濾膜，50 g/L脫脂奶37 ℃封閉1 h，加入一抗(兔抗人HOXB9多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體均購自Santa Cruz Biotechonology公司)，于4 ℃孵育過夜；加入二抗常溫孵育1 h，在凝膠成像儀內曝光成像，以β-actin為內參照。

1.2.3結果判定 ER和PR在腫瘤細胞中表達大于或等于1%記為陽性[11]。免疫組織化學中HER2染色大于75%，評分記3+，判斷為強陽性；HER2染色25%～75%，評分記2+，需采用FISH法進一步檢測HER2陽性；HER2有染色且小于25%，評分記1+；HER2無染色，評分記0，0及1+視為陰性[12]。ki-67>14%為高表達，Ki-67≤14%為低表達[13-14]。乳腺癌的分子亞型分類如下：Luminal-A型(ER和PR陽性，HER2陰性，ki-67低表達)；Luminal-B型(ER和/或PR陽性，且至少有以下1種：(1)HER2陰性，Ki-67高表達；(2)HER2陽性；HER2過表達型(ER和PR陰性，HER2陽性)；三陰型(ER，PR和HER2陰性)[15]。HOXB9的表達用以下公式計算：免疫組織化學得分=標記強度得分×陽性細胞百分比得分[14]。染色強度得分可分為0分(-)、1分(+)、2分(++)、3分(+++)。陽性細胞百分比得分描述為0分(無染色)，1分(<25%)，2分(25%～<50%)，3分(50%～<75%)和4分(≥75%)。免疫組織化學得分大于或等于6分為高表達，<6分為低表達。

1.3統計學處理 采用SPSS16.0軟件和Graph Prism6.0軟件分析數據。HOXB9蛋白表達與臨床病理特征的關系采用非參數檢驗，兩組間比較用Mann-WhitneyU檢驗，多組之間用Kruskal-Wallis檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法,差異行Log-rank檢驗;多因素分析用Cox比例風險模型。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1HOXB9在乳腺癌組織中高表達 133例乳腺癌免疫組織化學結果和臨床病理特征分析顯示,乳腺癌組織中有70例(52.6%)高表達HOXB9，癌旁組織中有56例(42.1%)高表達HOXB9,差異有統計學意義(χ2=19.8，P<0.01)。HOXB9在乳腺癌組織和癌旁組織的細胞核中高表達，見圖1。Western blot表明在20個新鮮乳腺癌組織中有18個高表達(90.0%)。HOXB9在乳腺癌和癌旁組織中表達水平分別為1.10±0.04，0.70±0.10，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

A：HOXB9在乳腺癌組織中的高表達；B：HOXB9在癌旁組織中低表達

圖1 HOXB9在乳腺癌及癌旁組織中的免疫組織化學結果(×400)

A:Western blot;B:HOXB9蛋白水平的統計分析;T:乳腺癌；N:癌旁組織

圖2 HOXB9在20對乳腺癌及癌旁組織表達的Western blot結果

2.2乳腺癌臨床病理資料與HOXB9表達的關系 研究結果表明,高表達的HOXB9與乳腺癌組織中ER表達水平、HER2表達水平、ki-67表達水平、淋巴結轉移、復發率、Luminal-B型密切相關,差異有統計學意義(P=0.030，P<0.01，P<0.01，P=0.016，P<0.01，P<0.01)。然而,HOXB9表達水平與年齡、腫瘤大小、Luminal-A型、HER2-過表達、三陰型乳腺癌無明顯相關性，差異無統計學意義(均P>0.05)。見表1。

表1 HOXB9的表達與乳腺癌患者臨床病理參數的關系(n,n=133)

續表1 HOXB9的表達與乳腺癌患者臨床病理參數的關系(n,n=133)

2.3HOXB9表達乳腺癌患者預后的關系 隨訪并記錄乳腺癌患者的生存期，隨訪時間為20～96個月，中位隨訪時間66個月。采用Kaplan-Meier法進行生存分析，結果顯示HOXB9高表達患者總生存期(OS)較HOXB9低表達患者短[(58.0±2.5)個月vs.(68.8±1.5)個月]，P<0.01,見圖3A。在Luminal-B型、Her2過表達型及三陰型患者中，HOXB9高表達患者OS較HOXB9低表達患者短，差異有統計學意義[(52.4±3.0)個月vs.(62.7±2.7)個月,P<0.01;(60.4±5.2)個月vs.(68.8±2.5)個月,P=0.008;(58.5±5.8)個月vs.(72.3±2.6)個月,P=0.041]，見圖3C～E。而Luminal-A型患者中，HOXB9高表達患者OS與HOXB9低表達患者差異無統計學意義[(76.0±6.3)個月vs.(73.5±3.9)個月,P=0.251],見圖3B。此外,單因素分析表明，HOXB9表達(P<0.01)，淋巴結轉移(P<0.01)，ki-67表達(P<0.01)，Luminal-B型(P=0.001)與乳腺癌患者的OS顯著相關，見表2。在Luminal-B型乳腺癌患者中，HOXB9表達(P<0.01)、淋巴結轉移(P=0.033)、ki-67表達(P=0.001)與OS顯著相關；在HER2過表達型乳腺癌患者中，HOXB9表達(P=0.016)、淋巴結轉移(P=0.044)、ki-67表達(P=0.04)與OS顯著相關；三陰型乳腺癌患者中，HOXB9表達(P=0.05)、淋巴結結轉移(P=0.002)、ki-67表達(P=0.004)與OS顯著相關；在Luminal-A型乳腺癌患者中無相關因素與OS相關，見表2。多因素分析表明，乳腺癌患者中HOXB9表達(P<0.01)、淋巴結轉移(P=0.001)、ki-67表達(P<0.01)是OS的獨立影響因素。在Luminal-B型乳腺癌患者中，HOXB9表達(P=0.013)、淋巴結轉移乳腺癌(P=0.02)是OS的獨立影響因素。在HER2過表達型腺癌患者中，HOXB9表達(P=0.026)、ki-67表達(P=0.002)是OS的獨立影響因素。在三陰型乳腺癌患者中，HOXB9表達(P=0.037)、淋巴結轉移(P=0.003)是OS的獨立影響因素。在Luminal-A型患者中，無因素與OS相關，見表2。

圖3 不同HOXB9表達的乳腺癌患者OS曲線

表2 影響乳腺癌患者OS的單因素、多因素分析(n=133)

續表2 影響乳腺癌患者OS的單因素、多因素分析(n=133)

淋巴結轉移中，<4個記為+，≥4個記為-

3 討 論

乳腺癌的復發和遠處轉移已經成為乳腺癌患者死亡的主要原因[15]。乳腺癌作為一種異質性疾病，具有許多獨特的生物學特征。不同分子分型(Luminal-A、Luminal-B、Her2過表達型和三陰型)的預后和治療策略不同。然而，很少有研究探討HOXB9在乳腺癌不同分子分型中的預后價值。因此，本研究不僅分析了整體的乳腺癌患者的預后，也分析了不同分子分型的乳腺癌患者的預后。

同源異型盒(HOX)基因的異常表達常發生在腫瘤組織中[5]。已有多項研究表明，HOX基因在胚胎發生過程中會產生復雜的作用，或許HOX基因在癌細胞中的異常表達與其促進腫瘤細胞生長有關，例如促進其侵襲性、遷移性和增殖活性。有研究表明，HOXB9在胃癌中高表達，HOXB9可能是胃癌患者預后不佳的一個新標志[16]。也有研究表明，HOXB9的過表達與白血病、小兒急性髓系白血病(AML)[17]、肺癌[9]、腦膠質瘤[18]的進展和轉移有關。根據以往的研究可發現HOXB9在不同的腫瘤中扮演著不同的角色。然而，HOXB9在乳腺癌中的表達和臨床重要性尚不清楚。

本研究通過免疫組織化學實驗觀察到HOXB9在乳腺癌中的表達明顯高于相應的癌旁組織。高表達的HOXB9在乳腺癌患者中與其臨床特征顯著相關，包括ER表達水平、HER2表達水平、ki-67表達水平、淋巴結轉移、復發率、Luminal-B型。此外，Western blot結果顯示，HOXB9在乳腺癌組織中的高表達，與免疫組織化學結果一致。筆者猜測HOXB9在乳腺癌中的高表達可能與啟動子區域的甲基化有關。然而，其全面真實機制需要進一步調查。綜上所述，HOXB9在乳腺癌中的高表達可能與乳腺癌的發生、侵襲性及腫瘤分化有關。

與Luminal-B、Her2過表達和三陰型患者相比，Luminal-A型患者HOXB9高表達與OS無明顯相關系。這可能與該研究中Luminal-A型患者數量較少有關。此外，Cox風險評估提示HOXB9是乳腺癌術后獨立預后因素，但本研究未能闡明HOXB9的分子機制。筆者推測HOXB9是通過調控乳腺癌內質網應激反應發揮癌基因作用，其具體的分子機制需要進一步研究。

本研究表明HOXB9在乳腺癌中的表達具有組織特異性，但它并不是直接使乳腺上皮細胞惡變[18]。HOXB9在乳腺癌中的異常表達可能會促進腫瘤的進展，而不是腫瘤發生。然而，現有的研究還不足以在HOXB9和它們所導致的癌癥之間建立精確的因果聯系，也不足以明確HOXB9基因是如何影響腫瘤的組織特異性。

綜上所述，本研究發現HOXB9在乳腺癌中高表達，其表達與乳腺癌患者臨床特征、OS有關。HOXB9可能在乳腺癌的早期診斷和預后預測中起著重要作用，在臨床研究中也是必不可少的。然而，HOXB9促進乳腺癌進展的分子機制尚不清楚，需要進一步研究。