髓系細胞觸發受體-1對膿毒癥腸功能障礙大鼠瓜氨酸循環水平的影響*

沈麗娟,吳錫平,王 倩,孫月雯,關云艷

(南京中醫藥大學無錫附屬醫院重癥醫學科，江蘇無錫 214071)

膿毒癥時，腸上皮細胞數量減少、功能障礙，腸黏膜屏障破壞，腸道菌群移位，引起體內促炎性和抗炎性介質平衡失調，導致全身炎癥反應綜合征(SIRS)，最終造成多器官功能障礙(MODS)，這是膿毒癥發展過程中的一個主要病理過程[1-2]。髓系細胞觸發受體-1 (TREM-1)是一種跨膜糖蛋白，選擇性地表達于中性粒細胞和一部分單核細胞，它是感染性疾病炎癥激發及級聯放大的關鍵介質，可以增強炎性反應對機體的影響[3]。但正常腸道固有層巨噬細胞幾乎不表達TREM-1，是腸道防止炎性反應與組織損傷過強的重要機制[4]。目前已知TREM-1不僅參與了感染等急性炎性反應，同時在腸道急慢性炎癥中也起到了促進炎性反應和加重組織損傷的作用[4]。因此筆者推測在膿毒癥腸黏膜損傷時腸道TREM-1呈現高表達，并與腸黏膜的損傷程度相關。瓜氨酸是一種非蛋白質的氨基酸，主要由小腸黏膜上皮細胞吸收代謝谷氨酰胺產生[5]。前期研究證實，瓜氨酸可以作為診斷膿毒癥大鼠急性腸功能障礙的有效指標[6]。筆者推測腸黏膜組織TREM-1水平與血清瓜氨酸水平呈現相關性，能反映膿毒癥急性腸功能障礙的程度。本研究通過脂多糖(LPS)構建膿毒癥大鼠模型，用TREM-1特異性阻斷劑 LP17人工合成肽阻斷TREM-1，觀察腸黏膜組織TREM-1水平與血清瓜氨酸及腸黏膜組織病理學改變的關系，為膿毒癥急性腸功能障礙治療藥物新靶點的發現提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取健康8周齡雄性SD大鼠30只[北京維通利華公司，質量合格證：SCXK(京)2012-0001],體質量280～300 g。

1.1.2主要儀器 多用脫色搖床SYC-2101(蘇州捷美)，BM450A全自動組織包埋機(常州派斯杰醫療)，光學顯微鏡[日本Olympus公司DX45顯微鏡及其自帶的計算機圖像分析系統(DP2-BSW)]，JEM-1010透射電子顯微鏡(日本電子公司)，帶電化學檢測器的高壓液相色譜儀(HPLC-PED，美國Dionex公司)。1525高效液相色譜儀、2489紫外檢測器(美國Waters公司)，XBridge C18色譜柱(5 μm,4.6×250.0 mm)，Empower2色譜工作站。Elx-800酶聯免疫分析儀(美國BioTek公司)，LightCycler480基因擴增儀(美國BioER公司)。

1.1.3主要試劑 LPS(L2880-100MG，美國Sigma公司)。LP17人工合成肽由上海科肽生物科技有限公司合成，采用Fmoc法經去保護、激活和交聯、循環3步合成，序列為LQVTDSGLYRCVIYHPPL，相對分子質量2 074.41，HPLC分析其純度為98.22%。腫瘤壞死因子α(TNF-α)和TREM-1 ELISA 試劑盒(上海滬峰化工有限公司，貨號F11310-A、F3151-A)。乳果糖、甘露醇(美國Sigma公司)。蘇木素-伊紅染色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，Trizol RNA Isolation(美國Invitrogen公司)，SYBR?Premix ExTaq TMⅡ、逆轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]，引物序列(上海博彩生物技術有限公司)，TREM-1單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司，編號23400R)。

1.2方法

1.2.1動物模型及分組 雄性SD大鼠30只分為正常組(A組)、模型組(B組)及LP17組(C組),每組10只。模型組及LP17組大鼠腹腔注射4.5 mg/kg LPS進行造模[7]。大鼠出現心率加快(為造模前心率2倍)、血壓下降、精神萎靡、少動、豎毛、口鼻分泌物增多等視為造模成功[8]。造模成功后，C組尾靜脈注射TREM-1特異性阻斷劑LP17人工合成肽(24.5 mg/kg)[9]，其余兩組尾靜脈注射等量生理鹽水。實驗期間自由進食飲水。72 h后各組大鼠灌胃乳果糖100 mg、甘露醇50 mg混懸液2 mL，放置代謝籠，留取24 h尿液。

1.2.2標本采集及檢測 大鼠下腔靜脈取血，將收集的血液標本經1 000 r/min離心5 min，取上清液，-80 ℃保存，統一檢測。取血后處死，打開腹腔，觀察并記錄腸管顏色，有無水腫、出血、擴張及穿孔等情況。取回腸用10%福爾馬林固定，常規取材，脫水，石蠟包埋，切片經HE染色。

1.2.3病理檢測 光學顯微鏡觀察腸壁絨毛有無水腫，黏膜上皮細胞有無變性、壞死，黏膜下層、肌層、漿膜層、固有層有無充血、水腫、炎細胞浸潤。按Chiu氏6級評分[10]評價病變程度，由輕到重依次評為1～5分，無明顯病變為0分。用圖像分析軟件測量腸壁絨毛長度、黏膜層厚度，求出每只大鼠平均絨毛長度與黏膜層厚度的比值(絨毛長度/黏膜層厚度)。

1.2.4腸黏膜通透性 帶電化學檢測器的高壓液相色譜儀(HPLC-PED)檢測尿液中乳果糖與甘露醇的濃度[11]，計算比值(L/M)。淋洗液0.1 mol/L NaOH，流速1.0 mL/min，檢測電極+0.1 V，氧化電極+0.75 V，還原電極-0.01 V，進樣量25 μL。

1.2.5血清瓜氨酸水平 運用高效液相色譜法檢測[12]，色譜條件：25 mmol/L醋酸銨緩沖(pH6.0):甲醇=90∶10→85∶15(8 min)→55∶45(10 min)→10∶90(10 min)，流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm，進樣量20 μL。

1.2.6血清TNF-α、TREM-1水平 ELISA檢測血清TNF-α、TREM-1水平。具體步驟如下：加樣，加酶標液，密封酶標板，37 ℃孵育，反復清洗酶標板，吸水紙拍干，加入顯色劑A和顯色劑B，37 ℃下避光反應10～15 min，加入終止液終止反應，酶標儀檢測光密度(OD)值，波長450 nm，根據檢測結果繪制標準曲線，計算樣本濃度。

1.2.7回腸組織TREM-1 mRNA表達 將50 mg的冷凍回腸組織按照說明書提取總RNA。-80 ℃保存。采用RT-PCR兩步法進行檢測，通過溶解曲線、2%瓊脂糖凝膠電泳確定產物的準確性，采用Real Time-PCR方法進行相對定量，標準化比值計算公式采用2-△△CT法[13]。以大鼠β-actin作為內參基因，檢驗所用引物序列見表1。

表1 大鼠回腸目的基因和內參基因引物序列

1.2.8免疫組織化學檢測TREM-1表達 石蠟切片脫胎換骨蠟、水化，PBS沖洗，加入3%H2O2,室溫孵育10 min,PBS沖洗，抗原修復，PBS沖洗。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30 min，加入TREM-1一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜，PBS沖洗，加入二抗，37 ℃孵育1 h，PBS沖洗。DAB染色2～5 min，顯微鏡下觀察，PBS沖洗10 min，蘇木素復染2 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10 min，梯度乙醇脫水、透明、樹膠封片，鏡檢。

2 結 果

2.1各組大鼠血清TREM-1、TNF-α、瓜氨酸水平 實驗結束時，B組大鼠死亡3只，A組與C組無死亡。與A組比較，B組與C組血清TREM-1、TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，血清瓜氨酸水平明顯降低(P<0.05)；與B組比較，C組血清TREM-1、TNF-α水平明顯下降(P<0.05)，血清瓜氨酸水平明顯升高(P<0.05)，見表2。3組大鼠血清TREM-1水平與TNF-α呈正相關(r=0.920,P=0.001)，見圖1。

表2 各組大鼠血清TREM-1、TNF-α、瓜氨酸水平比較

圖1 血清TREM-1與TNF-α的相關性分析

2.2回腸組織TREM-1 mRNA表達 B組與C組回腸組織TREM-1 mRNA表達0.56±0.12、0.30±0.09較A組無表達明顯升高(P<0.05);與B組比較，C組回腸組織TREM-1 mRNA表達明顯降低(P<0.05)。

2.3免疫組織化學檢測回腸組織TREM-1表達 TREM-1陽性表達呈黃色或棕黃色的染色顆粒，在A組回腸組織中未檢測到TREM-1的表達，B組與C組回腸組織中有TREM-1表達，C組表達量較B組減少，見圖2。

A：A組；B：B組：C：C組

圖2 各組回腸組織TREM-1的表達(×200)

2.4回腸黏膜形態及病理學情況 A組：回腸由黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜層4層結構組成，各層次結構清晰。黏膜層表覆單層柱狀上皮，向腸腔突起形成細長的絨毛，排列整齊，均無異常。固有層內有腸腺，間質無水腫。黏膜下層為疏松結締組織，肌層較厚，漿膜為間皮，單層扁平狀。B組：大部分腸黏膜上皮抬高，絨毛較A組短、寬，向兩側倒伏，部分絨毛頂端脫落，絨毛頂端上皮下出現囊狀間隙，伴隨毛細血管充血。少部分出現黏膜層細長的絨毛，排列整齊，頂端上皮細胞無明顯變性，無明顯壞死。固有層腺體和間質，黏膜下層、肌層無明顯病變。C組：大部分腸黏膜絨毛上皮下間隙輕度擴大，伴隨毛細血管輕度充血。

與A組比較，B組與C組回腸黏膜厚度、絨毛長度明顯降低(P<0.05)，Chiu氏評分明顯升高(P<0.05)；與B組比較，C組回腸黏膜厚度、絨毛長度明顯升高(P<0.05)，Chiu氏評分未見明顯差異(P>0.05)，見表3、圖3。

2.5回腸黏膜通透性改變 B組與C組回腸黏膜通透性3.57±0.38、2.35±0.27較A組0.19±0.02明顯升高(P<0.05)；與B組比較，C組回腸黏膜通透性明顯降低(P<0.05)。

表3 各組回腸黏膜形態及病理學比較

A：0分；B：1分；C：2分

圖3 Chiu氏評分情況

圖4 回腸組織TREM-1 mRNA表達與血清瓜氨酸水

2.6回腸組織TREM-1 mRNA表達與血清瓜氨酸及Chiu氏評分相關性分析 B、C組回腸組織TREM-1 mRNA表達與血清瓜氨酸水平呈負相關(r=-0.974,P=0.000)，與Chiu氏評分呈正相關(r=0.914,P=0.000)，見圖4。

3 討 論

2000年BOUCHON等[3]首次發現TREM-1為一種跨膜糖蛋白，選擇性地表達于中性粒細胞和一部分單核細胞，是感染性疾病炎癥激發及級聯放大的關鍵介質，其可以增強炎性反應對機體的影響[3]。TREM-1與配體結合后激活下游信號通路，導致細胞合成TNF-α、白細胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8等促炎因子，同時抑制抗炎因子IL-10的合成；而TNF-α、IL-8等可協助LPS上調TREM-1的表達，IL-10則抑制TREM-1的上調，從而產生激發和放大炎性反應的惡性循環[14]。研究顯示，膿毒癥時所有效應細胞的TREM-1均呈現特異性的高表達，且細胞表面的TREM-1表達明顯增高[15]。本研究與上述研究結果一致，膿毒癥大鼠血清TREM-1明顯升高，并與TNF-α呈正相關，證實TREM-1參與膿毒癥的發生、發展過程。

正常腸道固有層巨噬細胞幾乎不表達TREM-1，是腸道防止炎性反應與組織損傷過強的重要機制[4]。研究發現，TREM-1不僅參與了感染等急性炎性反應，同時在腸道急慢性炎癥中也起到了促進炎性反應和加重組織損傷的作用[4]。有報道，重癥胰腺炎大鼠腸組織內TREM-1高表達，促進炎癥介質釋放和腸黏膜屏障功能障礙，促進炎癥因子釋放，導致SIRS，誘發和加重 MODS[16]。抑制腸巨噬細胞TREM-1的表達可減輕氧化應激對腸黏膜屏障的損傷[17]。膿毒癥時，腸上皮細胞凋亡增加，細胞數量減少，腸上皮細胞功能障礙，腸黏膜屏障破壞，腸道菌群失調，腸道免疫功能受損，導致腸腔內毒素入血，引起炎癥介質釋放增多，使腸黏膜屏障進一步受損，大量細菌和毒素易位，引起體內促炎性和抗炎性炎癥介質平衡失調，導致惡性循環，加重SIRS，最終導致MODS[1-2]。本研究發現，膿毒癥時腸黏膜絨毛長度及黏膜層厚度降低，通透性增加，回腸組織TREM-1呈現高表達，并與腸黏膜的損傷程度相關，提示TREM-1參與了膿毒癥腸功能障礙的發生、發展。

瓜氨酸是一種非蛋白質的氨基酸，主要由小腸黏膜上皮細胞吸收、代謝谷氨酰胺而產生[18]。瓜氨酸被釋放入肝門靜脈系統，但肝組織對瓜氨酸沒有首過效應，肝臟中的瓜氨酸絕大部分被腎臟攝取后代謝為精氨酸[18]。研究發現，血清瓜氨酸水平能反映諸多小腸疾病(如短腸綜合征、放射性腸炎、克羅恩病)患者小腸黏膜上皮細胞的數量[7]。前期研究證實，血清瓜氨酸水平能夠反映膿毒癥腸黏膜上皮細胞的數量和功能[19]。臨床研究發現，急性腸功能損傷的危重癥患者血清瓜氨酸水平降低,是死亡的獨立危險因素之一[20]。本研究發現，膿毒癥大鼠血清瓜氨酸水平降低，并與回腸組織TREM-1 mRNA表達呈負相關，給予膿毒癥大鼠尾靜脈注射TREM-1特異性阻斷劑LP17人工合成肽后，回腸組織TREM-1 mRNA表達有所降低，腸黏膜損傷程度減輕，同時血清瓜氨酸水平有所升高，提示TREM-1能夠影響膿毒癥血清瓜氨酸水平，進一步證實TREM-1在膿毒癥腸急性功能障礙中有重要意義。

TREM-1是感染性疾病炎癥激發及級聯放大的關鍵介質，TREM-1能夠影響膿毒癥血清瓜氨酸水平，反映膿毒癥急性腸功能障礙的程度。驗證了TREM-1作為膿毒癥急性腸功能障礙分子治療靶點的價值，找到抑制TREM-1活性的藥物為改善膿毒癥急性腸功能障礙患者的預后提供了新的思路和有效的治療策略，這將成為下一步研究的重要方向。