IL-1β介導膿毒癥大鼠血管α1腎上腺素能受體失敏機制的研究*

梁家林，劉良明，董 惠

(1.空軍杭州特勤療養中心，杭州 310013；2.陸軍軍醫大學大坪醫院野戰外科研究所二室/創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042；3.陸軍軍醫大學免疫研究所，重慶 400038)

盡管研究不斷深入，但膿毒癥發病率和病死率始終居高不下[1]，血管低反應性(即血管對血管活性物質的反應性降低)是致使其高病死率的重要原因[2]。

研究證實，白細胞介素(IL)-1β介導膿毒癥血管低反應性發生，含NO依賴和非依賴性機制[3]，但針對上述機制進行糾正卻只能部分恢復血管反應性[4-5]，提示可能存在其他機制。基于α1腎上腺素能受體(α1ARs)在心血管系統中的重要作用，目前認為α1ARs失敏(主要是表達下降)是導致膿毒癥后難治性低血壓發生的重要原因[6]。筆者前期研究發現IL-1β能通過JAK2-STAT3途徑介導膿毒癥休克家兔血管α1ARs失敏[7]。另有研究顯示，IL-1β通過核因子-κB(NF-κB)途徑在轉錄而不是轉錄后水平降低小鼠血管α1ARs的表達[8]。由于α1ARs的表達調控具有種屬和組織的差異性[9]，多種屬作用機制的研究有利于闡述其詳細作用機制，本文重點研究IL-1β對膿毒癥大鼠α1ARs的表達調控機制。

目前已經克隆出大鼠血管平滑肌細胞(VSMCs)的α1ARs各亞型(α1AAR、α1BAR、α1DAR)的啟動子區域，其中相同的轉錄因子結合區域僅有Sp1和AP2[10-12]。筆者前期研究顯示：IL-1β對VSMCs α1ARs各亞型表達均有類似幅度的下調作用[7]，推測IL-1β可能通過Sp1和AP2在轉錄水平調控VSMCs α1ARs表達，另外也研究IL-1β是否通過改變α1ARs mRNA半衰期在轉錄后水平調控VSMCs α1ARs表達。

1 材料與方法

1.1實驗動物 體質量(200±10)g的SPF級健康成年雌性SD大鼠由陸軍軍醫大學實驗動物中心提供，通過陸軍軍醫大學倫理委員會審批。

1.2主要試劑與儀器 重組大鼠IL-1β(美國Pepro Tech公司)，兔抗大鼠α1AAR抗體(美國Epitomics公司)，山羊抗大鼠α1BAR、α1DAR抗體(美國Santa Cruz公司)，兔抗大鼠Sp1、AP2抗體(美國Pierce公司)，放線菌素D(美國Invitrogen公司)，X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑(美國Roche公司)，雙螢光素酶定量試劑盒(美國Gene Copoeia公司)，Power Lab八道生理記錄儀(澳大利亞AD Instrument公司)，垂直板狀電泳儀(美國Bio-Rad公司)，CO2細胞培養箱(美國SHEL/JB公司)，ABI Prism 7700(美國Perkin Elmer公司)。

1.3方法

1.3.1膿毒癥模型的復制及指標檢測 將32只大鼠分為假手術組、經盲腸結扎穿孔(CLP)3 h組、CLP 6 h組及CLP 12 h組，每組8只。采用CLP復制膿毒癥模型，手術操作、分組處理和血管環制作同文獻[13]，測定各組血管環的α1ARs敏感性[對去氧腎上腺素(PE)的反應性][7]；另游離出各組腸系膜上動脈(SMAs)分支，用RIPA裂解液提取其總蛋白，用蛋白質印跡法(Western blot)檢測α1ARs、β-actin表達。分析上述指標與IL-1β濃度的關系。

1.3.2IL-1β對大鼠VSMCs α1ARs、Sp1、AP2表達水平的影響 原代培養SMAs來源的VSMCs[13]，實驗分為對照組、1 ng/mL IL-1β組、10 ng/mL IL-1β組和100 ng/mL IL-1β組，每組4瓶細胞。IL-1β孵育VSMCs方法同文獻[13]，用RIPA裂解液提取各組細胞的總蛋白，用Western blot檢測α1ARs、Sp1、AP2、β-actin表達。

1.3.3IL-1β對大鼠VSMCs α1ARs mRNA半衰期的影響 IL-1β孵育VSMCs方法同前，在對照組或100 ng/mL IL-1β孵育12 h后加入放線菌素D(終濃度為4 μg/mL)[14]，依次加入放線菌素D后0、2、4、6 h后Realtime-PCR檢測α1ARs mRNA表達水平。所得Cq值結合標準曲線得到各組的量。引物序列見表1。

1.3.4Sp1和AP2 siRNA對大鼠VSMCs α1ARs表達的影響 實驗分為空白對照組、FAM siRNA(陰性對照)組、AP2γ siRNA組、AP2α siRNA組、Sp1 siRNA組，每組4瓶細胞。細胞準備：取融合度40%左右的原代培養的大鼠VSMCs，PBS清洗2次，加入1 800 μL含20%胎牛血清的DMEM F/12培養基。配制轉染復合物：193 μL DMEM F/12培養基，2 μL X-tremeGENE HP DNA，5 μL 20 mol/L的siRNA溶液(空白對照組加入5 μL無酶水)，室溫混勻放置15 min。孵育細胞：將轉染復合物加入各組細胞后細胞培養箱中培養72 h，RIPA裂解液提取各組總蛋白，Western blot檢測Sp1、AP2、β-actin及α1ARs表達水平。Sp1：正義siRNA 5′-GGA GCG AUC AUC UGU CAA ATT-3′，反義siRNA 5′-UUU GAC AGA UGA UCG CUC CTT-3′；AP2γ：正義siRNA 5′-UGU CAC CAC CGG AAU GCU UTT-3′，反義siRNA 5′-AAG CAU UCC GGU GGU GAC ATT-3′；AP2α：正義siRNA 5′-GGA GAG CGA AGU CUA AGA ATT-3′，反義siRNA 5′-UUC UUA GAC UUC GCU CUC CTT-3′；FAM：正義siRNA 5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3′，反義siRNA 5′-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3′。

1.3.5IL-1β對大鼠VSMCs α1DAR啟動子活性的影響 實驗分為對照組和100 ng/mL IL-1β 組，每組6瓶細胞?？寺ˇ?DAR啟動子并構建入質粒(GeneCopoeia公司代做)，擴增質粒，用X-tremeGENE HP DNA轉染試劑將質粒轉染入VSMCs(轉染方法基本同1.3.4)，加入100 ng/mL(終濃度)IL-1β孵育，對照組僅加入轉染試劑，24 h后吸取兩組培養基，dual luciferase assay試劑盒按說明書操作檢測兩組培養基

表1 引物序列

與Gaussia螢光素酶(gaussia luciferase,GLUC)和分泌性堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,SEAP)反應產生的光強度，GLUC/SEAP光強度即為啟動子活性。

2 結 果

2.1膿毒癥大鼠α1ARs敏感性和各亞型蛋白表達及與血清IL-1β的關系 與假手術組相比，在CLP后3、6和12 h，大鼠SMAs的α1ARs敏感性和各亞型蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，見圖1。筆者前期研究結果顯示血漿IL-1β水平在CLP后6 h明顯升高，相關性分析顯示其與同時期SMAs的α1ARs敏感性及蛋白表達水平呈明顯負相關(r=-0.823、-0.864，P<0.05)。

a：P<0.05，與假手術組比較

圖1 膿毒癥大鼠α1ARs敏感性和蛋白表達變化

2.2IL-1β對大鼠VSMCs α1ARs、AP2和Sp1表達的影響 與對照組相比，各濃度IL-1β組大鼠VSMCs α1ARs各亞型的蛋白表達均明顯降低(P<0.05)，而且呈濃度依賴性降低。各濃度IL-1β均能明顯降低AP2和Sp1表達(P<0.05)，見圖2。

2.3IL-1β對大鼠VSMCs α1ARs mRNA穩定性及啟動子活性的影響 與對照組比較，100 ng/mL IL-1β組大鼠VSMCs α1ARs各亞型的mRNA穩定性無明顯改變(P>0.05)。100 ng/mL IL-1β能明顯降低大鼠VSMCs α1DAR啟動子活性(P<0.05)，見圖3。

a：P<0.05，與對照組比較

圖2 IL-1β對大鼠VSMCs α1ARs、AP2和Sp1表達的影響

2.4Sp1和AP2對大鼠VSMCs α1ARs表達的影響 空白對照組和陰性對照組間α1ARs表達無明顯差異(P>0.05)。與空白對照組或陰性對照組相比，Sp1 siRNA、AP2α siRNA和AP2γ siRNA組均能明顯降低VSMCs α1ARs各亞型的蛋白表達(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.05，與對照組比較

圖3 IL-1 對大鼠VSMCs α1ARs mRNA穩定性及α1DAR啟動子活性的影響

a：P<0.05，與空白對照組比較;b：P<0.05，與陰性對照組比較

圖4 Sp1、AP2 siRNA對大鼠VSMCs α1ARs表達的影響

3 討 論

盡管對膿毒癥的認知水平有明顯提高，但在全球范圍內，其發病率、病死率均較高。鑒于α1ARs在心血管系統中的重要作用，它在膿毒癥的發生、發展和轉歸中具有重要地位。

研究顯示膿毒癥時存在血管α1ARs失敏，主要是受體減少，親和力無明顯改變[8]。體內外研究均顯示IL-1β能下調膿毒癥時血管α1ARs表達量[6-7]，但是對其調控機制目前不甚清楚。

本研究通過CLP復制膿毒癥大鼠模型，整體水平驗證膿毒癥時存在α1ARs失敏且與IL-1β相關。結果顯示CLP 3 h后即存在α1ARs失敏和表達量進行性下降，但α1ARs親和力無明顯改變，而血漿IL-1β卻在CLP 6 h后開始升高[13]。IL-1β濃度升高晚于α1ARs失敏，可能因為膿毒癥早期其他細胞因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)對α1ARs失敏也有作用。而在IL-1β升高后α1ARs進一步失敏，相關性分析顯示二者存在明顯負相關。為排除膿毒癥時其他細胞因子的干擾，筆者在離體時采用重組大鼠IL-1β孵育大鼠VSMCs，觀察其對α1ARs表達的影響。結果顯示IL-1β能明顯降低α1ARs各亞型的表達。整體和離體水平驗證了IL-1β通過下調α1ARs各亞型的表達介導膿毒癥α1ARs失敏的發生。

盡管已有研究顯示IL-1β通過下調小鼠血管α1ARs啟動子活性在轉錄而不是轉錄后水平下調α1ARs的表達。但現有研究提示α1ARs各亞型的表達、分布和調控機制具有種屬和組織的差異性，IL-1β對小鼠的作用機制是否適用于大鼠甚至人類，目前不得而知。通過運用轉錄抑制劑(放線菌素D)，發現IL-1β并不能改變大鼠VSMCs α1ARs各亞型 mRNA的半衰期，提示IL-1β也可能是通過轉錄而不是轉錄后介導大鼠血管α1ARs表達下降。為驗證這一結論，筆者隨機選擇檢測α1DAR啟動子活性，結果顯示IL-1β能明顯下調大鼠VSMCs α1DAR啟動子活性，盡管沒有檢測α1AAR和α1BAR啟動子活性，但仍然可以得到IL-1β通過轉錄水平介導大鼠VSMCs α1ARs表達下降這一結論。

目前α1ARs各亞型在大鼠VSMCs的啟動子區域已經克隆出來， α1AAR主要有Sp1、NF-κB、NF/IL-6、AP1、CTF/NF1、AP2等轉錄因子的結合區域[10]，α1BAR主要有Sp1、HNF-1/5、AP2、NF1、CREB、CP1等的結合區域[11]，而α1DAR則主要有Sp1和AP2的結合區域[12]。它們都有Sp1和AP2的結合區域，上述結果提示IL-1β對大鼠VSMCs α1ARs各亞型的表達存在相同的下調作用，且下調趨勢基本一致，為此筆者推測IL-1β可能通過相同的轉錄因子(Sp1和AP2)發揮調節作用。筆者檢測了IL-1β對大鼠VSMCs Sp1和AP2表達的影響，發現IL-1β能明顯降低Sp1和AP2的蛋白表達。Sp1和AP2的蛋白表達下調是否引起α1ARs的表達下降呢？通過運用Sp1和AP2(含AP2α和AP2γ)siRNA，發現Sp1和AP2表達下降使得α1ARs各亞型表達下降。由于α1AAR和α1BAR還有其他轉錄因子結合區域，也可能在IL-1β介導的膿毒癥大鼠血管α1ARs失敏中發揮作用。鑒于本研究得出Sp1和AP2在膿毒癥大鼠血管α1ARs失敏中的重要作用，值得進一步的研究，未來可以考慮作為膿毒癥的治療靶點。

綜上所述，IL-1β可能通過下調大鼠VSMCs 的Sp1和AP2表達，在轉錄而不是轉錄后水平下調α1ARs表達，介導膿毒癥大鼠血管α1ARs失敏的發生。