運(yùn)用無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析AURKB介導(dǎo)骨肉瘤惡性表型的分子機(jī)制

皮聞森，劉家明，黃山虎

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 330006)

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，多發(fā)于兒童和青少年。雖然新輔助化療藥物使用后患者生存率有所提高(55%～80%)，但是5年生存率未見提高。并且發(fā)生肺部轉(zhuǎn)移的患者5年生存率低于20%，肺轉(zhuǎn)移是OS患者的主要死亡原因[1]。因此，闡明OS轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制為骨肉瘤轉(zhuǎn)移的防治提供有效的策略及靶點(diǎn)，提高生存率是非常必要的。研究表明AURKB 在多種惡性腫瘤中高表達(dá)與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[2]。筆者前期研究表明AURKB高表達(dá)與OS肺部轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，并促進(jìn)OS細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[3]。然而，AURKB促進(jìn)OS細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的分子機(jī)制尚不清楚。本研究采用慢病毒轉(zhuǎn)染、無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選差異表達(dá)蛋白，結(jié)合生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)AURKB促進(jìn)OS惡性表型的關(guān)鍵蛋白和潛在的分子調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步探討AURKB促進(jìn)OS轉(zhuǎn)移分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 人OS細(xì)胞143B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),AURKB-shRNA慢病毒(Lv-shAURKB)和陰性對(duì)照慢病毒(Lv-negative)購(gòu)于上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。cDNA 第一鏈合成試劑盒及 PCR 試劑盒購(gòu)于天根生化科技(北京)有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖?BB-3101)購(gòu)自上海BestBio公司。凝膠制備試劑盒(AR018)購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)公司。AURKB 單克隆抗體(兔抗人)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。β-actin 單克隆抗體(鼠抗人)、HRP標(biāo)記山羊抗兔多克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗鼠多克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司。高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive和液相色譜均購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞分組：D組為L(zhǎng)v-shAURKB轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，C組為陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染Lv-negative)。按照上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供的慢病毒轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前1天以2×104/mL細(xì)胞懸液接種6孔板，每孔總體積為2 mL，在 5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。依照感染復(fù)數(shù)50，每組3個(gè)孔，鋪板24 h后，分別加入Lv-shAURKB慢病毒和 Lv-negative慢病毒 2 μL，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后 12 h換DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。感染48 h后觀察慢病毒侵染結(jié)果，消化轉(zhuǎn)移細(xì)胞至50 mL培養(yǎng)瓶中，以含0.25 μg/mL嘌呤霉素的DMEM完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)2周，得到穩(wěn)定細(xì)胞系。不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.2蛋白質(zhì)譜

1.2.2.1蛋白還原烷基化及酶解上機(jī) 用細(xì)胞刮刀刮取收集細(xì)胞，加入裂解液苯甲基磺酰氟(PMSF)，超聲3 min后于冰上裂解30 min。高速離心15 min(4 ℃,15 000 r/min)，取上清。蛋白采用500 mmol/L三乙胺碳酸(TEAB)緩沖液重溶。使用BCA蛋白試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白濃度，隨后將各個(gè)樣品100 μg轉(zhuǎn)移到新試管中，用8 mol/L 尿素調(diào)至100 μL定容。加入11 μL 1× MDTT并在37 ℃下溫育1 h，然后將樣品加到10 K超濾管14 000×g離心10 min后,加入120 μL 55 mmol/L碘乙酰胺，在室溫下避光溫育20 min。在超濾管中用100 mmol/L TEAB 連續(xù)離心3次置換Urea 體系后，用1∶50的胰蛋白酶酶解過夜。

1.2.2.2液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜(LC-MS/MS)上機(jī)測(cè)定 將凍干后的肽段重溶于30 μL溶劑A(A:0.1%甲酸水溶液)后用nano-LC分離，經(jīng)在線電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析。實(shí)驗(yàn)在Nano ACQUITY UPLC系統(tǒng)(Waters Corporation公司,Milford,MA，美國(guó))上進(jìn)行，系統(tǒng)連接裝有在線Nano電噴霧離子源的Q-Exactive 質(zhì)譜儀(Thermo Fisher Scientific,MA,美國(guó))。10 μL肽段樣品以10 μL/min流量上樣到捕集柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap C18,100 μm × 2 cm)，隨后在分析柱(Acclaim PepMap C18,75 μm × 15 cm)中以線性梯度分離120 min內(nèi)3% B至32% B(B:0.1%甲酸ACN溶液)。柱子在初始條件下平衡10 min。柱流量控制在300 μL/min，電噴霧電壓2 kV。Q-Exactive質(zhì)譜儀在數(shù)據(jù)依賴采集模式下運(yùn)行，自動(dòng)在MS和MS/MS采集間切換。在70 K質(zhì)量分辨率下獲得全掃描譜圖(m/z 300～1 800)，隨后在17.5 K分辨率下進(jìn)行后續(xù)HCD MS/MS掃描。動(dòng)態(tài)排除時(shí)間10 s。

1.2.2.3數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索 串聯(lián)質(zhì)譜圖經(jīng)過PEAKS Studio version 8.5(Bioinformatics Solutions公司,Waterloo,加拿大)分析。PEAKS DB對(duì)swiss prot-human數(shù)據(jù)庫(kù)(ver.201604,20191 entries)搜庫(kù)，設(shè)置胰蛋白酶酶解。搜庫(kù)參數(shù)碎片離子質(zhì)量容許誤差：0.05，母離子質(zhì)量容許誤差：7 ppm，最大漏切數(shù)：2，固定修飾：Carbamidomethylation 57.02，可變修飾：Oxidation(M)15.99，Deamidation(NQ)0.98，Acetylation(Protein N-term)42.01。肽段經(jīng)過1% FDR 和 1 unique peptide質(zhì)控過濾。篩選差異倍數(shù)1.5以上，具有2條unique 肽段，根據(jù)ANOVA算法取P<0.05的蛋白作為差異蛋白。

1.2.3生物信息分析 使用pheatmap軟件(https://CRAN.R-project.org/ package=pheatmap)完成構(gòu)建聚類分析熱圖，使用ggplot2軟件(http://ggplot2.org)構(gòu)建火山圖，運(yùn)用Blast2GO v.4進(jìn)行GO功能分析，差異蛋白的功能統(tǒng)計(jì)使用Fisher′s精確測(cè)試進(jìn)行檢驗(yàn)計(jì)算。運(yùn)用 KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)進(jìn)行KEGG通路富集分析，并使用STRING分析構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。聚類分析是一組將研究對(duì)象分為相對(duì)同質(zhì)的群組的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù),分析通過pheatmap軟件生成聚類熱圖。火山圖是在x,y軸上表示倍數(shù)變化及P值的散點(diǎn)圖，根據(jù)顯著性變化的閾值為分界線可以看出數(shù)據(jù)分布情況。

2 結(jié) 果

2.1聚類熱圖和火山圖 慢病毒轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞經(jīng)無標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)處理，共篩選到了105個(gè)差異表達(dá)蛋白，見圖1。

A：聚類熱圖；B:火山圖

圖1 聚類熱圖和火山圖

2.2GO分析結(jié)果 共計(jì)生物學(xué)過程773條，細(xì)胞組成156條，分子功能122條。前20個(gè)條目差異蛋白主要參與單生物體細(xì)胞器組織和細(xì)胞骨架組織的生物學(xué)過程；發(fā)揮RNA結(jié)合和肌動(dòng)蛋白依賴性ATP酶活性的分子功能；主要定位于細(xì)胞質(zhì)和膜界限的細(xì)胞器。見圖2。

2.3KEGG分析 KEGG分析顯示涉及150條，前20個(gè)條目見表1。差異蛋白富集的主要信號(hào)通路有肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、局部黏著和RNA運(yùn)輸?shù)取?/p>

表1 KEGG分析結(jié)果(前20條信號(hào)通路)

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)圖 以degree≥9篩選節(jié)點(diǎn)蛋白，即核心蛋白。顯示的核心蛋白有：ACTN4(degree=9)、TPR(degree=9)和ACLY(degree=16)。若刪除這些核心蛋白后，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性降低。見圖3。

圖3 差異蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

3 討 論

無標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于各種癌癥的研究[4],發(fā)現(xiàn)了與癌癥相關(guān)的蛋白，可用于癌癥的診斷、治療和預(yù)防，同時(shí)闡明癌癥發(fā)生的分子機(jī)制，讓人們從致病機(jī)制上認(rèn)識(shí)癌癥，理解其致病的分子網(wǎng)絡(luò)圖。本研究將無標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)用于OS中單個(gè)癌基因AURKB介導(dǎo)OS惡性表型的研究。共鑒定到105個(gè)差異表達(dá)蛋白，在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，核心蛋白包括ACTN4、TRP和ACLY。從GO分析和KEGG通路富集分析的結(jié)果來看，差異蛋白主要參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的生物學(xué)過程和起到調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白依賴性ATP酶活性的分子功能，主要富集的通路為肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)。

細(xì)胞骨架是細(xì)胞內(nèi)不同蛋白質(zhì)纖維的聚合物和各種調(diào)控蛋白交錯(cuò)連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，在維持真核細(xì)胞的形態(tài)、胞內(nèi)運(yùn)輸和變形運(yùn)動(dòng)等方面發(fā)揮著重要作用。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的細(xì)胞骨架有明顯的差異,細(xì)胞骨架的異常改變已成為反映腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為的特征之一。細(xì)胞骨架的重組影響著細(xì)胞的遷移，而腫瘤細(xì)胞遷移能力是其轉(zhuǎn)移主要因素之一[5]。差異蛋白中涉及細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的有ACTN4、PFN、MLC、PPP1R12A等，其中ACTN4是PPI網(wǎng)絡(luò)圖中的核心蛋白。ACTN4是一 種 非 肌 肉 的 細(xì) 胞 骨 架 蛋 白,參與細(xì)胞骨架重組，細(xì)胞質(zhì)分裂，調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附及形態(tài)，與多種腫瘤細(xì)胞的侵襲、遷移有關(guān)，包括乳腺癌細(xì)胞[6]和肝癌細(xì)胞[7]等。在肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)通路中，ACTN4的激活與Rho/ROCH的活性有關(guān)[8]。Rho是一種的GTP酶，屬于Rho-GTPase家族，而Rho GTPases家族是Ras超家族的一個(gè)亞家族，也是細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)通路中的一部分[9]。因此，筆者推測(cè)AURKB可能通過Rho/ROCH-ACTN4信號(hào)通路介導(dǎo)骨肉瘤的侵襲、遷移。

ACLY是ATP檸檬酸裂解酶,是脂肪酸生物合成過程中的關(guān)鍵酶，是糖代謝和脂肪酸合成的連接點(diǎn)。ACLY 位于脂質(zhì)代謝通路最上游，其催化產(chǎn)生的乙酰 CoA 是合成脂肪酸和膽固醇等脂類物質(zhì)的主要原料，能提高脂肪酸合成酶(FASN)的活性[10]。下調(diào)ACLY表達(dá)能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[11]。據(jù)報(bào)道，ACLY受到PI3K-Akt信號(hào)通路的調(diào)控，Akt還能通過激活膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白 1(SREBP-1)上調(diào)ACLY mRNA水平[12]。SREBP-1是脂質(zhì)代謝重要的核轉(zhuǎn)錄因子之一,主要調(diào)控脂肪酸、三酰甘油和膽固醇的生物合成[13]。另外，SREBP-1能夠與FASN啟動(dòng)子上的SREBP結(jié)合位點(diǎn)E-box序列強(qiáng)烈結(jié)合，通過 Akt-(SREBP-1)-FASN 信號(hào)通路使得FASN的表達(dá)增加[14]。筆者前期的研究已經(jīng)證實(shí)抑制FASN可通過PI3K/Akt信號(hào)通路降低OS細(xì)胞的惡性表型[15]，相反，Akt的抑制亦能降低FASN的活性[16]。目前的研究并未證實(shí)AURKB與FASN之間是否存在相關(guān)性。因此，筆者推測(cè)ACLY可能是AURKB與FASN協(xié)同調(diào)控的連接點(diǎn),AURKB可能通過PI3K/Akt-(SREBP-1)-ACLY/FASN信號(hào)通路介導(dǎo)骨肉瘤的惡性表型。

TRP是一種瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白，是一種參與離子轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白質(zhì)。TRP通道可以作為細(xì)胞內(nèi)外刺激，諸如缺氧等的傳感器和效應(yīng)器，從而介導(dǎo)相應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)，這些細(xì)胞反應(yīng)常常涉及升高的遷移活性和/或細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌[17]。TRP參與了多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，包括胃癌[18]和前列腺導(dǎo)管癌[19]等。研究報(bào)道，TRP通過ERK/NF-κβ介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性表型，通過ERK介導(dǎo)capase-3級(jí)聯(lián)反應(yīng)拮抗細(xì)胞凋亡[20]。但是TRP在OS中的作用機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道。筆者推測(cè)TRP/ERK/NF-κβ信號(hào)通路可能同樣在AURKB介導(dǎo)OS的侵襲、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，但有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，AURKB可能通過3條信號(hào)通路介導(dǎo)骨肉瘤惡性表型，即：Rho/ROCH-ACTN4信號(hào)通路、PI3K/Akt-(SREBP-1)-ACLY/FASN信號(hào)通路和TRP/ERK/NF-κβ信號(hào)通路。本研究為進(jìn)一步研究AURKB促進(jìn)OS惡性表型的分子機(jī)制提供了方向。盡管無標(biāo)記定量蛋白組學(xué)技術(shù)有助于豐富和識(shí)別與疾病有關(guān)的機(jī)制，然而這些關(guān)鍵基因的確切功能還需要今后更大樣本量的實(shí)驗(yàn)研究。