靶向納米探針在結直腸癌干細胞熒光成像及光熱治療中的研究

曹 永，呂 強，孫迎燕，高曉虹

(1.遵義醫學院法醫病理教研室,貴州遵義 563099；2.牡丹江醫學院醫藥研究中心，黑龍江牡丹江 157011；3.牡丹江醫學院紅旗醫院超聲科，黑龍江牡丹江 157011；4.牡丹江醫學院生物技術實驗室，黑龍江牡丹江 157011)

腫瘤干細胞(cancer stem cell,CSC)概念是MACKILLOP等[1]于1983年提出,認為CSC是維持腫瘤生長的核心，是腫瘤發生侵襲轉移的根源。LAPIDOT等[2]于1994年將急性髓性白血病中CD34+CD38-的瘤細胞接種到非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫(NOD/SCID)小鼠體內時能形成腫瘤，進而證實CSC的存在。隨后，證實CSC是腫瘤組織內具有自我更新和異體種植成瘤能力的一小群細胞[3-4]，如在乳腺癌、結腸癌等中均分離出CSC[2-4]。眾多學者認為腫瘤侵襲由少數具有特殊表型的細胞做誘發，這些細胞具有與CSC相似的特性[5-6]。目前，諸多研究已證實CD44可以參與細胞間的信號傳導，并與腫瘤的生長、侵襲、轉移及造血干細胞的歸巢等密切相關。在胃癌、結腸癌、肝癌等中普遍存在CD44v6表達失控，CD44v6高表達與腫瘤進展、轉移及預后等過程有關[7]。然而，關于CD44在結直腸癌侵襲轉移中的作用仍未明確。而上轉換納米粒子(up-conversion nanoparticles,UCNPs)具有生物安全性高、抗光漂白作用強、發光穩定性好，且易與抗體相耦聯等優點。因此，本實驗擬構建CD44v6功能化UCNPs探針，并將其應用于體外結直腸癌CSC的熒光成像及光熱治療，為結直腸癌的早期診斷及治療提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器 六水硝酸釔[Y(NO3)3·6H2O]、六水硝酸鐿[Yb(NO3)3·6H2O]、六水硝酸鉺[Er(NO3)3·6H2O]、六水硝酸銩[Tm(NO3)3·6H2O]等(上海莎博化工科技有限公司)，氟化鈉(NaF)、環己烷(C6H12)等(北京化學試劑公司)，1-乙基-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基丁二酰亞胺(NHS)、2-無水嗎啉乙磺酸(MES)等(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，CD44v6[NO:MCA1730，安諾倫(北京)生物科技有限公司]，透射電子顯微鏡JEM-1010(日本電子公司JEOL)，傅立葉紅外光譜分析儀Tensor 37(德國Bruker Optics公司)，980 nm激光器STL980AIO3-20.0W(北京思通博遠激光科技有限公司)，倒置相差顯微鏡TS100(日本Nikon公司)，小動物活體成像系統Berthold LB983 NC100(德國Berthold Technologies公司)等。

1.2實驗方法

1.2.1UCNPs制備 制備UCNPs時參考熱解法合成[8],對實驗步驟修正改進。

1.2.1.1鉺鐿共摻雜四氟釔鈉(NaYF4:Yb,Er)制備 稱取0.012 7 g氧化鉺(Er2O3)、0.118 0 g氧化鐿(Yb2O3)和0.300 5 g氧化釔(Y2O3)，滴入稀鹽酸加熱至溶解，結晶后待用。將去離子水、無水乙醇和油酸各10 mL加入燒瓶中，磁力攪拌10 min，將0.394 3 g氧化銨(NH4F)和0.106 4 g氫氧化鈉(NaOH)加入燒瓶攪拌10 min；將混合物移到反應釜，180 ℃持續720 min后冷卻至室溫，將反應物經4 000 r/min,離心20 min，乙醇洗滌3次，70 ℃烘干備用。

1.2.1.2銩鐿共摻雜四氟釔鈉(NaYF4:Yb,Tm)制備 將NaYF4:Yb,Er制備中的Er2O3用Tm2O3替代，其余方法步驟同1.2.1，即得NaYF4:Yb,Tm。

1.2.2NaYF4:Yb,Er/Tm的表面修飾 配置Lemieux-von Rudloff氧化劑[去離子水30 mL、偏高碘酸鈉(NaIO4)2.6 g、高錳酸鉀(KMnO4)0.036 g]，稱0.2 g NaYF4:Yb,Er用正己烷和乙醇超聲3次，22 000 r/min離心,向離心產物中加入100 mL環己烷、70 mL叔丁醇、10 mL去離子水和5 mL 5%的碳酸鈉(Na2CO3),攪拌20 min；向混合物加入30 mL Lemieux-von Rudloff氧化劑，將混合物于40 ℃攪拌24 h，將產物，22 000 r/min離心30 min，洗滌再離心上述產物；將產物分別分散在50 mL(pH4～5)鹽酸中,攪拌30 min后經11 000 r/min，離心30 min、70 ℃干燥備用。NaYF4:Yb,Tm的表面修飾方法用NaYF4:Yb,Er的表面修飾。

1.2.3透射電鏡 將待檢測樣品充分分散后取適量放置到銅網上壓片檢測，用電鏡觀察UCNPs形貌及尺寸(加速電壓100 kV；點分辨力 0.24 nm)。

1.2.4熒光分光光度計檢測 將待測樣品調制10 mg/mL,室溫下將樣品用連續激發980 nm激光器的熒光光譜儀進行測定，掃描范圍200～800 nm；

1.2.5傅立葉紅外光譜儀檢測 取干燥樣品與溴化鉀(KBr,1∶100)研磨成細粉狀，壓片后置傅立葉紅外光譜中分析顆粒表面的化學基團，掃描范圍250～4 000/cm。

《舌尖上的中國》里有一段話：在這個時代，每一個人都經歷了太多的苦痛和喜悅，中國人總會將苦澀藏在心里，而把幸福變成食物，呈現在四季的餐桌之上。

1.2.6結直腸癌細胞DLD1培養 將DLD1細胞置含10%胎牛血清的DMEM培養瓶中，37 ℃、5% CO2培養箱孵育。棄DMEM培養液[含青霉素鈉100 IU/L，鏈霉素100 IU/L(pH7.2～7.4]，加入2～3 mL 0.25%胰酶消化，待細胞變圓或細胞間隙增寬時，終止消化，收集細胞離心，棄胰酶消化液，加入新鮮DMEM培養液，制成細胞懸液，按1∶3傳代至培養瓶中。

1.2.7四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測UCNPs對DLD1細胞抑制率 取對數生長期的DLD1細胞，用0.25%胰蛋白酶消化制備細胞懸液，96孔板接種DLD1細胞5.0×104/孔，設陰性對照組及調零組，每孔加不同濃度的UCNPs(NaYF4:Yb,Er或NaYF4:Yb,Tm 0、50、100、200、400、800、1 600 μg/mL)，每組設7個復孔,培養24 h；加入MTT(5 mg/mL)20 μL后繼續培養4 h，棄培養基，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL,振蕩10 min,在酶標儀570 nm下檢測吸光度(OD)值(用630 nm校準)；計算UCNPs對細胞抑制率，本實驗重復3次；細胞抑制率=1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%。NaYF4:Tm對DLD1細胞抑制率檢測方法同NaYF4:Yb,Er的檢測方法。

1.2.8制備CD44v6 UNCPs探針 取氧化的NaYF4:Yb,Er 10 mg分別加入MES緩沖液洗滌后離心，加7 mL MES緩沖液、5 mg EDC、15 mg NHS，磁力攪拌器反應1 h；將產物用PBS洗滌，11 000 r/min離心30 min；將產物放入3 mL PBS經0.22 μm過濾器濾過后，加入10 μL CD44v6單克隆抗體，室溫反應2 h，既得NaYF4:Yb,Er-CD44v6探針，4 ℃保存備用。NaYF4:Yb,Tm-CD44v6探針制備方法同NaYF4:Yb,Er-CD44v6。

1.2.9DLD1干細胞光熱治療 利用980nm激光器激發結合CD44v6 UCNPs探針對結直腸癌CSC進行光熱治療。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0軟件分析數據，各實驗組與對照組細胞抑制率比較采用方差分析(Analysis of Variance)，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1NaYF4:Yb,Er/Tm的表征 透射電鏡對NaYF4:Yb，Er和NaYF4:Yb,Tm進行形貌、晶體結構表征觀察，結果顯示，兩種UCNPs經謝勒公式計算，粒子直徑20～35 nm，均為六角相的UCNPs，圖1A、C圖示兩種UCNPs均有良好分散性，圖1B、D示兩種UCNPs在受到電子束激發時均具有同心圓環組成的選區多晶電子衍射圖樣。

A:NaYF4:Yb,Er圖像；B:NaYF4:Yb,Er電子衍射圖；C:NaYF4:Yb,Tm圖像；D:NaYF4:Yb,Tm電子衍射圖

圖1 透射電鏡對NaYF4:Yb,Er/Tm進行表征觀察

圖2 NaYF4:Yb,Er/Tm上轉換發光光譜圖

2.3NaYF4:Yb,Er/Tm表面修飾后表征 傅立葉紅外光譜檢測修飾前、后的NaYF4:Yb,Er/Tm。結果如圖5～6示，圖5、6中黑色線分別代表NaYF4:Yb,Er/Tm氧化前的振動光譜，圖5綠色線代表NaYF4:Yb,Er氧化后的振動光譜，圖6藍色線代表NaYF4:Yb,Tm氧化后的振動光譜，均在～1 640/cm處發現羧基(-COH)基團的伸縮振動譜，而在～3 417/cm處表現出寬頻帶吸收峰，對應羥基(-OH)基因的伸縮振動譜，UCNPs氧化后的振動譜比氧化前明顯增強，證實NaYF4:Yb,Er/Tm氧化后-COOH的存在，表明NaYF4:Yb,Er/Tm修飾成功。

圖3 NaYF4:Yb,Er上轉換發光機制

圖4 NaYF4:Yb,Tm上轉換發光機制

黑色線：NaYF4:Yb,Er氧化前振動光譜，綠色線：NaYF4:Yb,Er氧化后振動光譜

圖5 NaYF4:Yb,Er氧化前后紅外光譜

2.4MTT檢測2種UCNPs對DLD1細胞抑制率 NaYF4:Yb,Er(表1)和NaYF4:Yb,Tm(表2)細胞毒性分析結果顯示，1 600 μg/mL高濃度組細胞抑制率與陰性對照組(0 μg/mL)比較差異有統計學意義(NaYF4:Yb,Er,P=0.003；NaYF4:Yb,Tm,P=0.000)，其余各組與陰性對照組比較差異均無統計學意義(P>0.05)，實驗時采用中劑量濃度組(400 μg/mL)，所合成的NaYF4:Yb,Er/Tm在實驗過程中對腫瘤細胞無毒性。

黑色線：NaYF4:Yb,Tm氧化前振動光譜，藍色線：NaYF4:Yb,Tm氧化后振動光譜

圖6 NaYF4:Yb,Tm氧化前后紅外光譜

2.5NaYF4:Yb,Er/Tm熒光成像 用980 nm激光器分別對NaYF4:Yb,Er和NaYF4:Yb,Tm進行2 W/10 s連續紅外光激發，分別獲取粒子的明、暗場圖像和熒光像，并對圖像進行合并,以證明上轉換得到的紅、綠色熒光像和藍色熒光像是納米粒子本身受到激發所得。結果顯示(圖7)：采用980 nm連續激發取樣拍照。從圖7F中清晰得到NaYF4:Yb,Er紅、綠兩種熒光，從成像圖中可證實合成的納米粒子具有良好的發光性，且發光不受時間限制。

2.6CD44v6 UCNPs探針靶向DLD1 CSC熒光成像 12孔培養板每孔加入500 μL CD44v6 UCNPs探針，置37 ℃、5% CO2培養箱培養2 h，棄上清液，加1 000 μL PBS。DLD1細胞與探針共孵育后用PBS代替DMEM培養基以減少培養基中顏色對980 nm激光的影響。CD44v6-NaYF4:Yb,Er探針上轉換成像結果(圖8)示：CD44v6表達于細胞膜，尤其處于分裂晚期的細胞之間蛋白表達量明顯增多，CD44v6蛋白表達符合干細胞不對稱分裂特性。CD44v6-NaYF4:Yb,Tm探針上轉換成像圖(圖9)中可見熒光成像在腫瘤細胞表面呈簇狀分布或呈點狀分布，提示腫瘤細胞成像時對于發光較弱的熒光信號可以加大激發功率或延遲激發時間以便得到清晰圖像。

A：NaYF4:Yb,Er明場像;B：綠色熒光暗場像;C：A、B明場與暗場合并像;D：紅色熒光暗場圖;E：A、D明場與暗場合并像;F：NaYF4:Yb,Er明、暗場、紅綠色熒光合并像;G：NaYF4:Yb,Tm明場像;H：藍色熒光暗場像;I：G、H明、暗場合并像

圖7 UCNPs上轉換成像圖

A:明場像;B:綠色熒光暗場像;C:A、B明暗場合并像;D：紅色熒光暗場像;E：A、D明暗場合并像;F：紅、綠色熒光合并成黃色熒光像

圖8 CD44v6-NaYF4:Yb,Er上轉換熒光成像

A：明場像;B：藍色熒光暗場像;C：明暗場合并像

圖9 CD44v6-NaYF4:Yb,Tm上轉換熒光成像

A、B:1 W/50 s;C、D：2 W/50 s;E、F：3 W/50 s;G、H：4 W/50 s;I、J:5 W/50 s;K、L：6 W/50 s;M、N：7 W/50 s;O、P：8 W/50 s

圖10 腫瘤細胞光熱治療

2.7DLD1 CSC的靶向光熱治療 鑒于藍色熒光轉換為熱能效率高的特點，本實驗選擇被激發后發藍光的CD44v6-NaYF4:Yb,Tm探針，以不同功率不同時間的980 nm連續激發后，明確藍光轉換為熱能對細胞損傷的閾值,如圖10A～F示經1～3 W/50 s 980 nm激發后細胞形態未見明顯異常；圖10G、H圖顯示4 W/50 Rs 980 nm連續激發細胞后可見分裂末期兩個子細胞連接處明顯萎縮；圖10I、J和圖10K、L分別經5、6 W/50 s激發后部分細胞萎縮，包括細胞膜皺縮，細胞體積變小；圖10M、N示經7 W/50 s激發后細胞核核仁皺縮成團塊狀凝集，部分細胞核仁呈塊狀分布；圖10O、P示經8 W/50 s激發后細胞膜邊緣皺縮部分呈肉芽狀突起、破碎，細胞質內細胞器凝聚、蛋白質凝聚，細胞核部分核仁皺縮成團塊狀凝集。經上述不同功率980 nm激發照射，腫瘤細胞膜、細胞核等發生不同程度形態學變化。結果顯示：DLD1細胞在受到近紅外980 nm激發不超過3 W/50 s時，DLD1細胞不會受到明顯影響，因此，后續細胞光熱治療以4 W/50 s作為治療閾值。

A：明場像;B：暗場像;C：明暗場合并像;D：4 W/50 s熒光暗場像;E：4 W/50 s連續激發后明場像;F：治療前、后合并像顯示細胞體積明顯固縮

圖11 CD44v6-NaYF4:Yb,Tm光熱損傷成像圖

以980 nm、4 W/50 s激發特異性結合的納米探針(CD44v6-NaYF4:Yb,Tm對DLD1細胞進行光熱治療時)，結果如圖11中可見，腫瘤細胞在經980 nm、4 W/50 s連續激發后其細胞體積明顯固縮，細胞膜明顯皺縮、破壞等病理形態改變。

表1 NaYF4:Yb,Er對腫瘤細胞抑制率

表2 NaYF4:Yb,Tm對腫瘤細胞抑制率

3 討 論

結直腸癌確診需術后病理切片證實，發現時多數已進入中晚期，目前，結直腸癌治療仍以手術和化學藥物治療為主，但常規化學藥物因無抗腫瘤細胞的特異靶向性，其在殺傷腫瘤細胞的同時也對正常組織細胞產生損傷，并且易引起腫瘤細胞的耐藥性。隨著對CSC的深入研究發現，CSC決定了腫瘤的復發和侵襲轉移，同時腫瘤的耐藥性也取決于CSC的耐藥性[9-10]。因此，針對CSC的靶向治療可能是有效的腫瘤治療方案之一。目前，已有研究證實在多種惡性腫瘤如胃癌、結腸癌、肝癌等普遍存在CD44v6表達失控，CD44v6高表達與腫瘤侵襲、轉移及預后等密切相關[7]，另外，TODARO等[11]在2014年發現CD44v6既可能是一個生物標記物也可能是結直腸癌CSC治療性靶點之一。

基于以上研究，本實驗制備NaYF4:Yb,Tm UCNPs，經NHS/EDC偶聯CD44v6抗體的靶向探針，以期達到靶向結直腸癌CSC目的，并經分子成像技術實現對結直腸癌CSC的影像診斷及靶向光熱治療的作用鑒別，從而提高腫瘤治療效果。實驗結果顯示，制備UCNPs直徑為20～35 nm，粒徑均勻；經傅立葉紅外光譜檢測UCNPs修飾成功，具有良好的生物相容性及水溶液分散性；MTT檢測說明UCNPs實驗用量對DLD1細胞無毒性。通過體外實驗證實,該納米探針對CD44v6+的結直腸癌CSC有良好的靶向性，可實現上轉換熒光的實時成像，避免了生物發光成像中如熒光素酶半衰期的限制。關于UCNPs經980 nm激光器激發后是否對細胞本身造成影響的報道并不多見，SHEN等[12]報道HeLa細胞在接受近紅外激光獲得的輻射前、后顯微鏡圖像的對比圖發現，其細胞形態并沒有明顯差異。而高溫殺傷腫瘤細胞的具體作用機制目前仍未完全明確，一般認為有多種作用機制：高溫能夠破壞細胞核，尤其當溫度超過41 ℃時，細胞核、染色質可凝集成團塊，使蛋白質凝固變性，最終導致細胞死亡，并產生新的溶酶體使細胞發生自身溶解[13]，而激光作用于生物組織后，可以引起各種物理化學效應，因此使用激光治療各種疾病已被廣泛應用[14-15]。目前，針對腫瘤細胞熱治療多數研究的重點是光動力學治療[16]，但采用UCNPs本身作為直接熱殺傷腫瘤細胞的研究未見報道，因此本研究主要針對UCNPs本身在受到不同時間、不同功率980 nm激發后其局部的產熱作用，以達到殺傷結直腸癌CSC的目的，其研究結果顯示：DLD1 CSC經980 nm、4 W/50 s連續激發后其細胞體積明顯縮小，部分細胞核呈團塊狀凝集、固縮，細胞膜皺縮等病理改變，此研究結果表明UCNPs可在980nm激發后具有直接殺死腫瘤CSC的作用。

綜上所述，通過使用靶向納米探針，可實現對腫瘤CSC的實時無創性影像學診斷，又可實現對其靶向精準光熱治療，從而達到在殺死CSC的同時又達到了常規化學藥物不能達到的治療效果；同時，靶向納米探針可避免CSC耐藥性的產生，進而提高常規化學藥物對一般腫瘤細胞的治療效果。因此，UCNPs探針是一種具有良好應用前景的治療方案之一。本實驗下一階段將進一步探討UCNPs探針在體內對腫瘤的熒光成像及光熱治療作用，以及靶向納米載藥體系的構建和應用。