miR-135a-5p在乳腺癌患者血清中的表達及意義

黃俊婷，潘利咸，朱俊琳

(南陽醫學高等專科學校第一附屬醫院腫瘤內科,河南南陽 473000)

乳腺癌為女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率約占全身各種惡性腫瘤的10%，并呈逐年升高趨勢[1]。有資料顯示，早期乳腺癌患者經手術治療聯合放化療的治愈率可達90%左右[2]，但臨床對于晚期乳腺癌的治療尚缺乏有效手段，因此，探尋乳腺癌的早期診斷標記物具有重要的價值。糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)是臨床常用的乳腺癌診斷指標，其雖具有一定診斷價值，但存在假陽性率高、敏感度低等缺點[3]。微RNA(microRNA,miRNA)是近年來發現的一類長度為18～24個核苷酸的內源性小RNA，既往研究表明，miRNA在乳腺癌組織和正常乳腺組織中的表達存在差異[4]，最近有研究報道，miRNA可長期穩定地存在于血漿或血清中，其中，血清miR-135a-5p已被證實與子宮內膜癌[5]、結直腸癌[6]等惡性腫瘤密切相關，但其在乳腺癌中的表達及診斷效能尚未明確。因此，本研究通過對比分析80例乳腺癌患者，50例乳腺增生患者及50例體檢健康者血清miR-135a-5p表達水平，旨在為乳腺癌的臨床診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年1月至2018年1月本院收治的80例乳腺癌患者，50例乳腺增生患者及50例體檢健康者為研究對象，均為女性。乳腺癌組年齡32～67歲，平均(48.26±5.35)歲；病理類型：浸潤型導管癌42例，浸潤型小葉癌38例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期49例，Ⅲ期31例，患者均經組織病理學檢查確診為原發性乳腺癌且為初發病例，術前未接受放化療治療。乳腺增生組年齡30～65歲，平均(47.49±4.28)歲，均經臨床檢查確診且為初發病例。體檢健康組年齡29～71歲，平均(49.03±6.13)歲。本研究經醫院倫理委員會批準，且研究對象均知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血清總RNA提取 收集3組血漿樣本，于采集48 h內離心處理(1 000 r/min離心10 min)，取上層血清置于-80 ℃的冰箱中保存待檢，整個過程避免溶血。分別取血清400 μL，采用血清RNA提取試劑盒(美國Invitrogen公司)提取血清總RNA，應用紫外分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)檢測RNA的純度及濃度。

1.2.2反轉錄反應 按照反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)操作說明書進行操作，將提取的血清總RNA反轉錄為cDNA，反應體系為20 μL，配制混合物：總RNA 300 ng，5×RT buffer 4 μL，反轉錄特異性引物1 μL，脫氧核糖核苷酸2 μL，RNA酶抑制劑1 μL，反轉錄酶1 μL，加焦碳酸乙二酯(DEPC)水補至20 μL。反應條件：42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min；產物置于-20 ℃保存。miR-135a-5p及內參U6的反轉錄引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設計并合成。

1.2.3miR-135a-5p定量PCR檢測 采用7500型實時熒光定量PCR擴增儀(美國ABI公司)進行定量PCR檢測。反應體系：SYBR GreenⅠ混合液10.00 μL，U6上游引物0.25 μL(5′-CTC GCG CAG CCT TGA CA-3′)，U6下游引物0.25 μL(5′-AAC TTC GGA ATT GCA CTC GT-3′),miR-135a-5p上游引物0.25 μL(5′-ACA GCC TCC ATG GGA ATG GAA GCA GGT TGA-3′),miR-135a-5p下游引物0.25 μL(5′-TGG AGT GTG GCG TTC G-3′),cDNA酶6 μL，無RNA酶水3.00 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，30 ℃ 30 s,共40個循環。采用相對定量法，以U6為內參，各樣本中miR-135a-5p的水平為它與同樣本中的U6的比值為相對表達水平，由公式Folds=2-ΔΔCt計算獲得，ΔΔCt為miR-135a-5p的相對表達水平。

1.2.4CA125水平檢測 應用電化學發光免疫分析法測定卵巢癌腫瘤標記物CA125水平，試劑盒由中國聯科生物公司提供，嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行數據分析，數據以M(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney U檢驗，采用ROC曲線評價血清miR-135a-5p在乳腺癌中的診斷效能，以P<0.05為差異有統計學意義。陽性預測值及陰性預測值根據診斷實驗評價四格表計算。

2 結 果

2.13組血清miR-135a-5p的相對表達水平及CA125比較 由RT-PCR檢測結果可知，乳腺癌組、乳腺增生組、體檢健康組血清miR-135a-5p的相對表達水平分別為2.397(1.041，4.362)、0.935(0.398,1.917)、0.918(0.189,1.403)，血清CA125表達水平分別為(179.42±23.69)×103、(43.48±9.47)×103、(9.11±1.62)×103U/L。乳腺癌組血清miR-135a-5p的相對表達水平及CA125表達水平顯著高于乳腺增生組和體檢健康組，且差異均有統計學意義(U=349.0、308.0,均P<0.01)，而乳腺增生組血清miR-135a-5p的相對表達水平及CA125表達水平與體檢健康組比較差異無統計學意義(U=328.0，P=0.167)。

2.2血清miR-135a-5p及CA125對乳腺癌的診斷價值 miR-135a-5p診斷乳腺癌的靈敏度、陽性預測值及陰性預測值均高于CA125，其診斷特異度與CA125相同。miR-135a-5p聯合CA125診斷乳腺癌的靈敏度和陰性預測值均有所提升，見表1。

表1 血清miR-135a-5p及CA125對乳腺癌的診斷價值(%)

2.3乳腺癌患者血清miR-135a-5p相對表達水平與其臨床病理特征的相關性分析 乳腺癌患者血清miR-135a-5p相對表達水平與腫瘤的TNM分期及分化程度密切相關(P<0.05)，而與患者的年齡、是否絕經、腫瘤大小、病理類型無明顯相關性(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌患者血清miR-135a-5p相對表達水平與其臨床病理特征的相關性

2.4ROC曲線分析 采用ROC曲線評價血清miR-135a-5p在乳腺癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.847(95%CI：0.609～0.973)，診斷敏感度為91.82%，特異度為77.35%，見圖1。

圖1 血清miR-135a-5p診斷乳腺癌的ROC 曲線

3 討 論

乳腺癌為臨床常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年升高且呈年輕化發展趨勢，這對乳腺癌的臨床防治帶來極大挑戰[7]。有資料顯示，每年全世界約有50萬患者死于乳腺癌，盡管手術聯合同步放化療提高了早期乳腺癌的臨床治愈率，但對于晚期乳腺癌的治療尚缺乏有效手段[8]。因此，探尋乳腺癌的發病機制，明確其早期診斷的生物學標志物成為臨床研究的重點。近年來，隨著臨床對乳腺癌標志物的不斷探究，miRNA越來越受學者的關注，成為腫瘤生物標志物研究的新領域[9]。miRNA是近年來發現的一類長度為18～24個核苷酸的內源性小RNA，已有研究證實，miR-29[10]、miRNA-241[11]、miRNA-320[12]等與乳腺癌的發生發展存在相關性。雖然miRNA對乳腺癌的早期診斷具有一定價值，但多數研究基于癌組織或細胞miRNA的表達差異，在獲得檢測miRNA的腫瘤組織時需行穿刺或有創手術等，因此，此種檢測方式不便于臨床乳腺癌的廣泛篩查。

有資料顯示，miRNA在血液、唾液及尿液中也能被檢測到，且外周血中miRNA作為腫瘤標志物已取得一定成效[13]。王攀等[14]研究報道,血清miRNA-1246與乳腺癌的進展密切相關。另有研究報道，miR-21、miR-195、miR-222在早期乳腺癌患者血清中的表達上調，其對乳腺癌診斷的敏感度分別63.3%、70.0%和70.0%,特異度分別86.7%、93.3%和90.0%[15]。以上研究結果說明，血清miRNA有望成為乳腺癌的診斷標記物，miR-135a-5p為RNA-135家族的重要成員，位于第3號染色體，已被證實與多種惡性腫瘤密切相關[16-17]，而其與乳腺癌的關系尚未明確。

本研究顯示，乳腺癌患者、乳腺增生患者、體檢健康者血清miR-135a-5p的相對表達水平分別為2.397(1.041，4.362)、0.935(0.398,1.917)、0.918(0.189,1.403)，由此可知，乳腺癌患者血清miR-135a-5p的相對表達水平顯著高于乳腺增生患者和體檢健康者。結果提示，血清miR-135a-5p的高表達可能與乳腺癌的發生存在一定相關性。TAIPALEENMAKI等[18]研究報道，miR-135在轉移性乳腺癌患者血清中呈高表達，這與本研究結果一致。CA125為乳腺癌公認的血清診斷標記物，本研究中，CA125在乳腺癌患者血清中呈高表達。一般較理想的腫瘤標記物應具有靈敏度及特異性高，陽性預測值及陰性預測較為理想的特點。本研究顯示，miR-135a-5p診斷乳腺癌的靈敏度、陽性預測值及陰性預測值均高于CA125，其診斷特異度與CA125相同；與單指標診斷結果比較，二者聯合診斷乳腺癌的靈敏度及陰性預測均有所提升，結果提示，聯合診斷利于提高對乳腺癌的診斷效能。

本研究表明，乳腺癌患者血清miR-135a-5p相對表達水平與腫瘤的TNM分期及分化程度密切相關，而與患者的年齡、是否絕經、腫瘤大小、病理類型無明顯相關性。結果提示，分期越高、分化程度越低的乳腺癌患者血清miR-135a-5p水平呈升高趨勢，臨床監測乳腺癌患者血清miR-135a-5p水平可能對患者病情發展及預后評價有一定意義。進一步采用ROC曲線評價血清miR-135a-5p在乳腺癌中的診斷效能，其曲線下面積為0.847(95%CI：0.609～0.973)，診斷敏感度為91.82%，特異度為77.35%。結果提示，血清miR-135a-5p對乳腺癌具有較高的診斷價值。趙宇明等[19]研究發現，miR-135在前列腺癌患者血清中呈高表達，可作為前列腺癌診斷和預后的標志物。鄧道庭[20]研究報道，miR-135b-5p在胃癌外周血中呈高表達。VAN REMVE等[21]研究報道，miR-135b-5p與丙型肝炎病毒(HCV)相關肝癌發生存在相關性。有學者研究發現，miR-135b-5p診斷頭頸部鱗癌的敏感度和特異度均較高。以上研究結果表明，miR-135b-5p與多種惡性腫瘤的發生發展密切相關，其或將成為早期惡性腫瘤的一個非侵入性診斷標志物。

綜上所述，miR-135a-5p在乳腺癌患者血清中表達明顯上調，血清miR-135a-5p對乳腺癌診斷的敏感性和特異性均較高，其或將成為乳腺癌臨床診斷的生物學標志物之一。今后，本院會加大對樣本量的收集，深入探討血清miRNA對惡性腫瘤的診斷價值，以期為臨床診療提供更有價值的參考。