鐮形棘豆總黃酮通過TGF-β/Smad3通路抑制骨肉瘤MG63細胞EMT

馬金祥，馬金蘭，馬金華

(青海大學醫學院,西寧 810016)

骨肉瘤起源于骨間充質細胞，是最常見的原發性惡性骨腫瘤。其每年發病率在不同年齡段略有不同：在0～14歲內為4.0/百萬(3.5/百萬～4.6/百萬)，在0～19歲內為5.0/百萬(4.6/百萬～5.6/百萬)。在兒童易患的癌癥中，骨肉瘤發病率排在第8位。骨肉瘤發病率男性高于女性，呈雙峰型分布，在10～14歲時出現第1個高峰，與生長激素激增相關；在65歲以上人群中出現第2個高峰，與佩吉特氏病相關。最常見的部位是股骨、脛骨和肱骨。骨肉瘤的5年整體生存率為68%。最佳治療效果是在骨肉瘤轉移前手術完整切除?；熕幬锖突煼桨笇侨饬龅膹桶l和轉移依然至關重要。骨肉瘤具有發病率高、耐藥性強及易轉移等特點，導致其預后差[1]。盡管近年來，科學家們確定了幾種分子標記物，但敏感性和特異性欠缺。因此，開發新型藥物對原發性骨肉瘤的治療至關重要。

鐮形棘豆(oxytropis falcate)屬于棘豆屬，主要分布在中國西北部，在西藏和內蒙古被廣泛用于民間偏方。其全草在中藥中也被廣泛使用，主要用于治療發熱、流感、扁桃體炎、咽喉炎、急慢性支氣管炎、便血、痢疾等。現代藥理學研究發現其具有抑菌、抗氧化、抗炎、止血和抗腫瘤等藥效[2]，有效成分主要包括黃酮類、多酚類、多糖及生物堿等[3]。近年研究顯示鐮形棘豆總黃酮(flavonoids of oxytropis falcate,FOF)具有抗腫瘤效果，但主要集中在對肝癌的治療研究中[4]，對其他腫瘤的作用效果研究少見報道。2016年，李欽[5]發現FOF可抑制由轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的腎上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)引起的腎纖維化，其主要是通過抑制TGF-1β/Smads通路實現的。該通路在大部分轉移性腫瘤中被激活，促進腫瘤細胞EMT轉化[6]。因此，推測FOF可能會通過抑制TGF-1β/Smads通路抑制轉移性腫瘤的轉移能力。

為探索FOF是否可通過TGF-β/Smad3通路抑制骨肉瘤細胞EMT及其分子機制，為FOF首次應用于抗骨肉瘤轉移提供理論支持，本研選取骨肉瘤細胞MG63細胞系作為研究對象進行實驗。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑 MG63細胞購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。DMEM高糖培養液購自美國Gibco公司，胎牛血清(FBS)購自北京四季青生物科技有限公司，胰蛋白酶、RIPA裂解液、超敏型ECL檢測試劑、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE電泳液及蛋白免疫印跡(Western blot)轉膜液均購自上海碧云天生物技術有限公司，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、p-Smad3、磷酸化轉化生長因子β受體Ⅱ(p-TGF-βRⅡ)單克隆抗體購自英國Abcam公司，Transwell小室購自Millipore公司，TRIzol、反轉錄試劑盒、qPCR試劑盒均購自日本Takara公司，TGF-β1 ELISA試劑盒購自上海酶聯生物公司。引物信息：Twist正向引物5′-CTT GCC AAT CAG CCA CTG AC-3′;反向引物5′-CCA GTT TGA TCC CAG CGT TT-3′；Snail正引物 5′-CCT TCA GGC CAC CTT CTT TG-3′;反向引物 5′-TCC AGT AAC CAC CCT GCT GA-3′;GAPDH正向引物:5′-CCG AGG GCC CAC TA A AGG-3′；反向引物:5′-GCT GTT GAA GTC ACA GGA GAC AA-3′,以上引物由日本Takara公司合成。FOF由甘肅省中醫藥研究院中藥研究所提供。

1.2方法

1.2.1細胞培養 將MG63細胞用含有10% FBS的DMEM高糖培養液，置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養，待細胞貼壁生長至80%～90%融合度時傳代。

1.2.2細胞增殖實驗 取對數生長期細胞，胰酶消化成單細胞，并用含有10% FBS的高糖型DMEM培養基配制成1×105/mL濃度的單細胞懸液。于每孔100 μL加入到96孔板中，置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中培養24 h，待貼壁后，分別加入0、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μg/mL的FOF，其中0 μg/mL組加入相同體積的二甲基亞砜(DMSO)作為空白組，繼續培養24、48、72 h后，每孔加入5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍(MTT)20 μL，培養4 h，棄去培養基，每孔加入150 μL DMSO室溫避光溶解MTT，于490 nm處在酶標儀上檢測吸光度(OD)值。為排除藥物的誘導凋亡作用所引起的對以下實驗結果的影響，同時保證藥物的作用效果，本研究選取48 h作為處理時間、≤半數致死濃度(IC50)的兩個梯度濃度(25.0 μg/mL組、50.0 μg/mL組)作為處理濃度，進行后續實驗。

1.2.3細胞遷移實驗 在超凈工作臺中，將Transwell小室放入24孔板中，備用。取對數生長期細胞用0、25%胰酶消化并用無血清培養基配制成1.5×105/mL的單細胞懸液，以每孔400 μL加入到Transwell小室上室中，并在下室中加入600 μL含有20%血清的培養基，每組設6個平行對照。并分別加入0 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL的FOF，其中0 μg/mL組加入相同體積的DMSO作為空白組，放入37 ℃、含5% CO2培養箱中，培養48 h后，取出培養板，將Transwell小室取出，放入-20 ℃無水甲醇固定5 min，棉簽輕輕拭去上室中未遷移細胞后，0.25%結晶紫染色5 min，PBS洗去未染色結晶紫，顯微鏡下觀察拍照，并隨機選取6個視野計數細胞，統計遷移細胞數。

1.2.4ELISA實驗 取各組細胞，胰酶消化并用含有10% FBS的高糖型DMEM培養基配制成1×104/mL的單細胞懸液，以每孔1 mL種植于6孔板中，置于37 ℃、含5% CO2培養箱中培養至80%融合后，加入不同濃度藥物，每組設6個平行對照，于37 ℃、5% CO2培養箱中繼續培養48 h，收集上清液，離心后，按照ELISA試劑盒說明書進行實驗。

1.2.5qPCR實驗 MG63細胞在培養瓶底融合度達到80%后，加入不同濃度藥物處理48 h后，用TRIzol法提取總RNA，步驟如下：PBS洗滌MG63細胞，加入TRIzol于冰上裂解5 min，收集裂解液，13 000 r/min離心，收集上清液，加入氯仿，靜置離心，吸取上清液加入異丙醇，靜置離心，棄上清液，75%乙醇清洗沉淀，離心棄上清液，保留沉淀干燥，用焦碳酸二乙酸(DEPC)水溶解。然后按照日本Takara反應試劑盒依次經過去除基因組DNA反應、反轉錄反應和qPCR進行擴增，擴增程序為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃、30 s，40循環數。

1.2.6Western blot實驗 取各組細胞，PBS洗滌后，加入RIPA裂解液在冰上裂解細胞，待細胞裂解后收集于離心管中，繼續裂解30 min，13 000 r/min離心，收集上清液，測定蛋白濃度，加入4×上樣緩沖液，煮沸5 min，充分變性，-20 ℃保存備用。制膠：10%分離膠+5%濃縮膠；按蛋白濃度確定上樣量；然后經過電泳，轉膜，封閉，一抗孵育過夜，PBS洗滌，二抗室溫孵育1.5 h，PBS洗滌，ECL發光液顯色，X射線顯影，拍照，用Image pro plus軟件分析光密度值。

2 結 果

2.1FOF對MG63細胞增殖的影響 在相同時間下，隨著FOF處理濃度的升高，MG63細胞增殖抑制率逐漸升高，其中處理24、48、72 h的IC50分別為80.84、44.90、31.36 μg/mL；在相同濃度下，隨著處理時間的增長，MG63細胞增殖抑制率也逐漸升高。見圖1。

圖1 FOF對MG63細胞增殖的影響

A：空白組；B:25.0 μg/mL組；C:50.0 μg/mL組；D:定量分析；a：P<0.05，與空白組比較

圖2 FOF對MG63細胞遷移的影響

2.2FOF對MG63細胞遷移的影響 隨著FOF濃度的增大，遷移細胞逐漸減少，與空白組比較，25.0 μg/mL組和50.0 μg/mL組遷移細胞數均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05),見圖2。

2.3FOF對MG63細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達的影響 隨著FOF濃度的增大，E-cadherin表達逐漸增多，Vimentin表達逐漸減少，見圖3。

圖3 FOF對MG63細胞中E-cadherin、Vimentin蛋白水平的影響

2.4FOF對MG63細胞Snail1、Twist mRNA表達水平的影響 隨著FOF濃度的增大，Snail1、Twist mRNA表達水平逐漸減少，經統計，與空白組比較，25.0 μg/mL組和50.0 μg/mL組中Snail1、Twist mRNA表達變化差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

2.5FOF對MG63細胞上清液中TGF-β1水平的影響 隨著FOF濃度的增大，MG63細胞上清中TGF-β1水平逐漸減少。經統計，與空白組[(10.35±1.64)ng/mL]比較，25.0 μg/mL組[(6.98±0.91)ng/mL]和50.0 μg/mL組[(3.70±0.54)ng/mL]中TGF-β1水平變化差異有統計學意義(P<0.05)。

a:P<0.05，與空白組同種mRNA比較

圖4 FOF對MG63細胞Snail1、Twist mRNA表達水平的影響

圖5 FOF對MG63細胞中p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白的影響

2.6FOF對MG63細胞p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白表達的影響 隨著FOF濃度的增大，p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白水平逐漸減少，見圖5。

3 討 論

近年，由鐮形棘豆中提取的黃酮類物質逐步被各研究者發掘出具有抗腫瘤效果。楊光明等[7]發現FOF可通過調控Bcl-2/Bax的比率誘導肝癌SMMC-7細胞系凋亡。陳曉紅等[8]進一步對FOF引起SMMC-7721細胞凋亡的途徑進行探索，發現FOF可誘導細胞內Caspase-3、Cyt C蛋白表達水平升高，并伴隨線粒體膜電位發生變化，揭示FOF可通過線粒體凋亡途徑誘導SMMC-7721細胞凋亡。但是其對骨肉瘤的抗癌效果及對腫瘤轉移的影響并未見報道。因此，本研究選取MG63細胞為研究對象探索FOF抗骨腫瘤效果及對EMT的影響。通過MTT細胞增殖實驗發現FOF以時間和濃度依賴的方式抑制MG63細胞增殖，提示FOF具有一定的抗MG63細胞增殖的能力?？紤]到時間過長或濃度過高，細胞凋亡嚴重，而時間過短或濃度太低，對細胞代謝無影響，因此本研究選取48 h時的最接近IC50的左右兩個FOF濃度處理MG細胞。

EMT能夠使上皮細胞獲得類似于間質細胞的特征，使其具有較高的轉移能力。在大部分腫瘤獲得轉移能力的過程中，伴隨EMT轉化相關蛋白及通路發生異常[9]。在EMT轉化過程中，直接相關的蛋白有E-cadherin、N-cadherin、Vimentin，其中E-cadherin表達下調，N-cadherin和Vimentin表達上調。本研究發現經FOF處理后，MG63細胞遷移能力下降，E-cadherin蛋白表達上升，Vimentin蛋白表達下降。提示FOF可逆轉MG63細胞EMT，從而抑制MG63細胞遷移。研究發現[10]轉錄因子Snail1、Twist通過特異性識別E-box堿基序列下調E-cadherin mRNA表達，上調Vimentin mRNA表達，促進細胞EMT。本研究通過qPCR實驗發現FOF具有降低MG63細胞中Snail1、Twist mRNA的能力。以上提示FOF可通過抑制MG63細胞中Snail1、Twist mRNA表達，降低相應蛋白水平，逆轉EMT，達到抑制MG63細胞轉移的效果。

研究發現TGF-β1/Smads通路調控Snail1、Twist表達[11]。在多數腫瘤當中異常激活的TGF-β1/Smads通路通過誘導Snail1過表達介導EMT[12]。TGF-β1與細胞表面TGF受體結合導致TGF-βRⅡ磷酸化激活，并進一步磷酸化激活Smad3，p-Smad3進入細胞核啟動Snail1、Twist表達?；A研究發現很多藥物均可通過抑制TGF-β1/Smads通路逆轉腫瘤細胞EMT[12]。本研究發現FOF可降低MG63細胞上清液中TGF-β1的水平及MG63細胞中p-Smad3、p-TGF-βRⅡ蛋白水平。提示FOF可抑制MG63細胞分泌TGF-β1的能力，進而抑制Smad3、TGF- βRⅡ磷酸化水平。

綜上可知FOF對MG63細胞增殖具有抑制作用，并可通過抑制TGF-β1/Smads過度激活，逆轉MG63細胞EMT，從而降低MG63細胞轉移。由于與EMT轉化相關的信號通路還涉及其他多條通路，FOF是否還通過其他途徑逆轉EMT轉化，還需進一步實驗。