過表達人VEGF183誘導小鼠乳腺癌血管成熟

王曉銀，呂探宇，夏文姣，朱武凌，張會勇

(新鄉醫學院生命科學技術學院，河南新鄉 453003)

惡性腫瘤的生長和轉移離不開營養供應[1]。目前，研究最多的與腫瘤血管生成相關的因子是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。VEGF被認為是一種最重要的促血管生成因子，其因mRNA的剪切形成VEGF121、145、148、165、183、189與206等7種主要亞型[2-4]。VEGF通過與其受體VEGFR1、VEGFR2和Nrp1結合，在腫瘤血管生成中發揮著重要的作用[4]。有研究表明，VEGF各亞型與Nrp1結合能力的不同導致在腫瘤中不同的招募[5-6]。單核細胞表達Nrp1(Nrp1-expressing monocytes,NEMs)以自分泌的方式在新生血管周圍招募平滑肌細胞促進血管成熟[7]。CD31是內皮細胞表面標志物，表示血管密度(microvessel density,MVD)[8]。α-smooth muscle actin(αSMA)是周細胞表面標志物[9]，表示周細胞數(pericyte number,PN)，而αSMA在CD31中所占的比例(PN/MVD)表示血管成熟度[10]。已有研究表明，VEGF189和VEGF165可以促進血管成熟度[11]。筆者前期研究發現，過表達VEGF183(與VEGF189相比，在外顯子6a處少6個氨基酸)，可使瘤內微血管擴張[12]，但關于其對血管成熟度的影響，并未見相關研究報道。

本文主要研究穩定過表達VEGF183的乳腺癌細胞株EMT-6在BALB/C小鼠皮內接種后，對腫瘤血管成熟度的影響，并與過表達VEGF165和VEGF189做比較。現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 小鼠乳腺癌細胞株EMT-6購于美國ATCC公司，由本實驗通過脂質體穩定轉染獲得轉染pcDNA3.1空載體的EMT-6細胞株，EMT-6-pcDNA3.1(EMT-6細胞組，作對照)，過表達VEGF189的EMT-6細胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF189(EMT-6-189細胞組)，過表達VEGF183的EMT-6細胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF183(EMT-6-183細胞組)和過表達VEGF165的EMT-6細胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF165(EMT-6-165細胞組)細胞株(上述3種細胞株VEGF表達量接近)，保存于新鄉醫學院合成生物學工程實驗室(具體構建方法參考文獻[12])。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖液體培養基購于美國HyClone公司，血清購于美國BI公司，0.25%的胰蛋白酶購于吉林省吉諾生物醫藥技術有限公司。一抗：CD31兔抗小鼠(批號50408-T16)購于北京義翹神州生物技術有限公司，工作液濃度1∶2 000稀釋；α-SMA兔單抗小鼠(批號ab32575)購于英國Abcam公司，工作液濃度1∶300稀釋；免疫組織化學SP試劑盒(兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統，批號SP-9001)、即用型DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，其余化學試劑均為分析純級。

1.1.3實驗動物 雌性的6～8周齡的BALB/c小鼠(批次號11400700216964)購于北京維通利華實驗動物有限公司。本實驗中的實驗動物飼養與操作經新鄉醫學院動物倫理學委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞培養 穩定表達各VEGF亞型及載體的EMT-6細胞株于10%的胎牛血清與1%的雙抗的DMEM高糖培養基中，置于含5% CO2的37 ℃恒溫CO2培養箱中培養。

1.2.2樣本制備 12只BALB/C小鼠分為4組(EMT-6，EMT-6-189，EMT-6-183和EMT-6-165組)，每組3只。小鼠先腹部右側腋下脫毛，皮內接種 2.5×105個對應組細胞，待腫瘤長至直徑約為4～5 mm時，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腫瘤。腫瘤組織經4%多聚甲醛固定至少24 h，常規方法脫水透明浸蠟，石蠟包埋，石蠟切片機切片，厚度5 μm。

1.2.3免疫組織化學 石蠟切片經脫蠟水化；抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次3 min；3%的內源性過氧化氫阻斷劑阻斷，PBS洗3次，每次3 min；正常山羊血清封閉，吸去血清，一抗孵育，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加即用型生物素標記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色；蘇木素復染；自來水返藍；脫水至透明；中性樹脂封片。

1.2.4檢測指標的定性與定量 DAB染色后，分別于低倍鏡下和高倍鏡下觀察，陽性反應呈棕黃色，CD31為內皮細胞膜陽性，α-SMA為周細胞胞質陽性。MVD計數：首先在100倍視野下選擇計數的部位，然后在400倍視野下計數CD31陽性的血管數，每張片子選擇5個不同的視野計數，計算平均值即為MVD；PN計數：與CD31計數原則一樣，先在100倍視野下選擇計數部位，再在400倍視野下計數α-SMA陽性周細胞數，隨機選擇5個不同的視野計數，計算平均值即為PN。

2 結 果

2.1各組間MVD的比較 免疫組織化學結果顯示，CD31陽性主要表達在瘤周，EMT-6-183、EMT-6-165、EMT-6-189組與EMT-6組比較，CD31的陽性血管數呈現遞增的趨勢；與EMT-6組比較，EMT-6-189、EMT-6-183組的血管形態不同，相較于對照組與VEGF165組，VEGF183與VEGF189誘導出現了較大比例擴張的腫瘤微血管，見圖1A～D。而定量分析瘤周MVD表明：EMT-6-183組MVD為4.6±1.1，EMT-6-165組的為4.8±0.8，EMT-6-189組為6.8±1.3，EMT-6組為22.8±4.8，EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189組瘤周MVD與EMT-6組比較差異均有統計學意義(P<0.01)，而EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)，圖1E。

A:EMT-6組DAB染色(×400)；B:EMT-6-189組DAB染色(×400)；C:EMT-6-183組DAB染色(×400)；D:EMT-6-165組DAB染色(×400)；E:MVD計數統計分析；a:P<0.01,與EMT-6組比較

圖1 各組間的MVD表達情況及分析

2.2各組間PN的比較 α-SMA陽性細胞定位在血管外周，且主要分布在瘤周，符合周細胞的組織學分布，α-SMA陽性細胞形成管腔樣微血管，見圖2A～D。而PN的定量分析結果顯示，EMT-6組PN為6.6±2.9，EMT-6-189組為2.4±0.5，EMT-6-165組為2.2±0.4，EMT-6-183組為1.8±0.4，EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189組與EMT-6組比較均顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，而EMT-6-165、EMT-6-189、EMT-6-183組各組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2E。

2.3各組間PN/MVD的比較 EMT-6-183組誘導了39.2%的血管成熟度，而EMT-6-165、EMT-6-189組分別誘導了46.0%和35.38%的成熟度。EMT-6組的血管成熟度只有31.8%。

A:EMT-6組DAB染色(×400)；B:EMT-6-189組DAB染色(×400)；C:EMT-6-183組DAB染色(×400)；D:EMT-6-165組DAB染色(×400)；E:PN計數統計分析；a:P<0.01,與EMT-6組比較

圖2 各組間的PN表達情況分析

3 討 論

從已存在的血管中生出新血管的過程被稱為血管新生[13]。這一過程發生在缺血性疾病、炎癥性疾病和惡性腫瘤中，被稱為病理性血管生成[14]。通過對腫瘤血管生成的認識，幫助我們了解腫瘤的生物學特征，從而促進開展個性化治療。血管計數是評估血管生成的“金標準”[15]，但在某些惡性腫瘤中，血管的數目不能準確地反應腫瘤的惡性程度及生長速度。研究證實，腫瘤內血管成熟對于腫瘤的供血發揮著重要的作用[16]。周細胞和內皮細胞是血管的重要組成成分，參與誘導血管新生，同時周細胞又通過和內皮細胞相互作用共同調節血管的形成、穩定和重塑。

VEGF是已知的研究最多的促血管生長因子，本研究在EMT-6細胞株中分別穩定轉入pcDNA3.1-VEGF189、pcDNA3.1-VEGF183、pcDNA3.1-VEGF165，皮內接種于BALB/c小鼠。結果表明，周細胞和內皮細胞在各組中均有表達，而在EMT-6組內，因有內源性的VEGF120及VEGF164(對應于人VEGF121與VEGF165)表達，內皮細胞數表達量較多，形成管腔狀較小的血管且主要集中在瘤周，所以其瘤周MVD相對較高。但因周細胞主要表達于血管外周，表達量較少，因此PN/MVD值較低。而過表達VEGF165，尤其是過表達VEGF183與VEGF189導致血管管腔擴大，而致使瘤周血管數目減少，即瘤周MVD相對EMT-6組少。過表達VEGF189、VEGF183和VEGF165的小鼠，PN和MVD值組內差距較小，但是PN/MVD值均高于EMT-6組，且過表達VEGF183的小鼠PN/MVD值介于過表達VEGF189和過表達VEGF165之間。已有研究表明VEGF189和VEGF165能夠促進血管成熟[11]，而VEGF183與VEGF189相比，結構上少了6個氨基酸，可能一定程度上影響其空間結構，使其與VEGFR1、VEGFR2和Nrp1的結合能力不同，導致對成熟度的影響不同。

本研究結果表明VEGF183與其他VEGF亞型均可促進血管成熟。腫瘤血管的成熟度直接影響化療及免疫藥物的運輸[17-18]，從而影響腫瘤治療效果。本研究可為未來依據VEGF表達的類型及血管成熟度進行腫瘤個體化治療提供一定的理論基礎。