雌激素-ERα-36信號通路參與胃黏膜腸上皮化生的發生

桂華偉,王緒明,黃利華,黃 萱,陳瓊霞,劉麗江△

(1.湖北省武漢市第四醫院病理科 430032；2.病理診斷所組織病理部，湖北武漢,430056)

胃癌是全球發病率位居第4位的惡性腫瘤，而在中國,其發病率常高居第2位[1-2]。胃癌早期發現率低，一經發現多為進展期。5年生存率低，病死率高，居惡性腫瘤的第2位[1-2]。慢性萎縮性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是我國胃癌的主要癌前病變，其腸上皮化生(腸化)是CAG的重要病變之一。因此，腸化被認為是腸型胃癌的主要癌前病變[3]，但其發生機制不詳。

研究發現，男性與絕經期前女性胃癌發病率之比為2∶1，而女性絕經期后，這種差異逐漸消失。因此推測女性體內生理性較高濃度的雌激素可能阻礙或延緩了胃癌的發病[4-5]。來自大樣本量、多地區的流行病學報道，CAG的男性患者腸化發生率遠高于女性患者，而無幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染的女性患者絕經后CAG的發病率逐漸升高且病變加重。腸型胃癌的病變中出現腸化的比例及嚴重程度，男性往往高于女性。使用抗雌激素藥物他莫昔芬可降低伴有腸化的胃炎發生。動物實驗發現，雌性動物體內生理性較高濃度雌激素可阻礙CAG實驗動物模型中腸化的發生、發展[3,6-11]。因此，目前認為，腸化確實存在顯著的性別差異[12]。

1 材料與方法

1.1材料 BALB/c小鼠購于華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，雌性200只和雄性100只，6～8周齡，無特定病原體(SPF)級；N-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)購自上海潤成生物科技有限公司，ERα-36抗體由美國王兆一教授饋贈(克瑞屯大學，美國內布拉斯加州)，GES-1細胞購自湘雅醫學院實驗中心，COX-2抗體(sc-19999)、內參β-actin抗體(sc-517582)購自Santa Cruz公司，相應的辣根酶標記山羊抗兔IgG(ZB-5301)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG(ZB-5305)及通用型免疫組織化學SP試劑盒(小鼠/兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統，SP-9000)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。用于Western blot檢測的增強化學發光試劑ECL和BCA蛋白定量試劑盒為上海碧云天生物技術有限公司(上海，中國)產品。聚偏氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1BALB/c小鼠胃黏膜腸化動物模型構建 雌性小鼠200只，雄性小鼠100只，6～8周齡，體質量約20 g，選取100只雌性小鼠按文獻介紹的實驗方法去除雙側卵巢[13]，1周后待傷口愈合進行正式實驗，實驗分為3組，雌性小鼠100只，去除卵巢雌性小鼠100只和雄性小鼠100只。每組各挑選10只作為對照組，僅給予普通食物和飲水，其余90只用于建立小鼠胃黏膜腸化動物模型。將MNNG溶解于超純水中做成儲存液(儲存濃度為1 g/L)。使用前將儲存液用蒸餾水稀釋至終濃度100 μg/L。除對照組小鼠外其余組小鼠從鋁箔包裹飲水瓶中自由攝取MNNG溶液(唯一水源)。同時，給予不規律飲食(第1天足夠的飼料后第2天禁食，交替進行)。在10周后，處死解剖全部小鼠，通過鏡下觀察胃黏膜組織學變化(顯微鏡下觀察是否出現杯狀細胞及出現比例)以驗證是否成功建成小鼠胃黏膜腸化動物模型。所有動物實驗都經江漢大學醫學倫理學委員會批準。

1.2.2慢性胃炎人體組織標本中腸化發生率檢測 收集分析江大病理診斷所和湖北省武漢市第四醫院2010年1月至2016年12月所有慢性胃炎活檢標本共計5 326例，其中男3 084例，女2 242例。所有標本收集后，用10%的中性甲醛固定后，常規石蠟包埋，切片、制片、蘇木素-伊紅(HE)染色后，經兩個中級職稱及以上的病理專科醫生復片并對腸化程度分級(直徑少于1/3腺體出現腸化為1級輕度，1/3～2/3腺體出現腸化為2級中度，>2/3腺體出現腸化為3級重度)。因為圍絕經期(45～55歲)的雌激素變化情況比較復雜，所以去除圍絕經期女性和相應年齡的男性患者，僅僅研究未絕經和完全絕經的女性患者。所有人體組織標本的獲取都經江漢大學醫學倫理學委員會批準且患者知情同意。

1.2.3免疫組織化學檢測 免疫組織化學檢測嚴格按照通用SP試劑盒說明書進行操作，石蠟包埋切片常規脫蠟至水，經過氧化氫(H2O2)孵育10 min去除內源性過氧化物酶活性，檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復,然后10%胎牛血清室溫封閉10 min，一抗37 ℃孵育2 h，二抗37 ℃孵育30 min，最終用DAB顯色,蘇木素復染，脫水、透明、封片。

1.2.4Western blot實驗 收集慢性胃炎人體組織冰凍材料標本(伴有腸化和不伴腸化各15例)，用液氮研磨方法收集蛋白，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電泳后濕轉至PVDF膜，含5%脫脂奶粉的TBST(含0.1% Tween-20的TBS)37 ℃封閉60 min，一抗ERα-36、CDX-2、β-actin抗體4 ℃孵育過夜。TBST漂洗3次，每次5 min，加入相應的辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或羊抗兔IgG，37 ℃孵育60 min。TBST漂洗5 min×3次，ECL化學發光試劑檢測。

1.2.5細胞轉染和不同濃度雌激素聯合MNNG對GES-1細胞中ERα-36和COX-2表達的影響 ERα-36表達質粒和siRNA干擾質粒由王兆一教授饋贈，本實驗室保存。細胞轉染按照LipoFiterTMLiposomal Transfection Reagent試劑盒說明書操作步驟進行轉染。1×106個GES-1細胞被接種于10 cm直徑的培養皿中過夜，24 h后換新鮮培養基。按照說明書要求，將4.6 μg的ERα-36表達質粒(過表達組)或siRNA干擾質粒(干擾組)分別混合于4.8 μL LipoFiterTMLiposomal Transfection Reagent轉染試劑，分別轉染細胞。轉染6 h后換新的不含轉染試劑的培養基，接著培養48 h后，用于實驗。細胞分別用20 μmol/L的MNNG、0.1 nmol/L(生理性低濃度)的雌二醇(E2)、5 μmol/L(藥理性高濃度)的E2、20 μmol/L的MNNG聯合0.1 nmol/L的E2、20 μmol/L的MNNG聯合5 μmol/L的E2處理24 h后，用Western blot方法檢測ERα-36及COX-2的表達。

2 結 果

2.1BALB/c小鼠胃黏膜腸化動物模型構建 實驗結果顯示，建模10周時，雄性小鼠和去卵巢雌性小鼠中，腸化的發生率明顯高于雌性小鼠，見表1。雄性對照組，去卵巢雌性小鼠對照組和雌性對照組小鼠均未出現腸化現象。

表1 小鼠胃黏膜腸化動物模型出現腸化的性別差異(n)

χ2、P值為腸化發生率比較所得；a：雌性小鼠vs.雄性小鼠；b:雌性小鼠vs.去卵巢雌性小鼠；c:雄性小鼠vs.去卵巢雌性小鼠

2.2不同性別腸化的發生率 人體慢性胃炎組織材料中，男性與女性相比，男性腸化的發生率和嚴重程度高于絕經期前的女性，但是與絕經以后的女性差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 慢性胃炎人體組織出現腸化的性別差異及絕經影響

2.3人體組織標本免疫組織化學檢測結果 收集來源于江大病理診斷所和湖北省武漢市第四醫院的伴有重度腸化的慢性胃炎樣本和不伴有腸化的慢性胃炎新鮮人體組織樣本各20例，用免疫組織化學的方法檢測胃黏膜腺體中ERα-36和COX-2的表達，ERα-36、COX-2陽性表達主要定位于胃黏膜細胞的細胞膜和細胞質。用Image-pro plus 6.0軟件分析陽性表達區的平均光密度。結果顯示，伴有腸化的慢性胃炎樣本，ERα-36和COX-2的表達均明顯高于不伴有腸化的慢性胃炎樣本，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖1A～G。

2.4人體新鮮胃炎組織樣本Western blot實驗檢測結果 收集來源于江大病理診斷所的人體新鮮胃炎組織樣本，其中包括伴有重度腸化的慢性胃炎標本和不伴有腸化的慢性胃炎人體組織樣本各15例。用液氮研磨加上RIPA裂解液按照說明書方法提取組織蛋白后，加入蛋白酶抑制劑后放入-80 ℃冰箱保存。伴有重度腸化的慢性胃炎樣本中ERα-36和COX-2的表達均高于不伴有腸化的胃炎樣本，其差異有統計學意義(均P<0.05)，見圖1H～I。

A：伴有腸化的慢性胃炎HE染色(×200)；B：伴有腸化的慢性胃炎高表達ERα-36(×200)；C：伴有腸化的慢性胃炎高表達COX-2(×200)；D：不伴有腸化的慢性胃炎HE染色(×200)；E：不伴有腸化的慢性胃炎低表達ERα-36(×200)；F：不伴有腸化的慢性胃炎低表達COX-2(×200)；G：選取伴有腸化的慢性胃炎和不伴有腸化的慢性胃炎各100例，用免疫組織化學方法分別檢測ERα-36和COX-2表達，用Image-pro plus6.0軟件分析平均光密度；H：Western blot方法檢測伴有腸化的慢性胃炎(case 1～case 4)和不伴有腸化的慢性胃炎(case 5～case 8)中ERα-36和COX-2表達；I：伴有和不伴有腸化的慢性胃炎新鮮組織標本各15例，用Western blot方法分別檢測ERα-36和COX-2表達，用Image-pro plus6.0軟件分析平均光密度

圖1 伴有和不伴有腸化的慢性胃炎標本中ERα-36和COX-2表達

2.5不同濃度E2對ERα-36和COX-2表達的影響 實驗結果顯示，單獨使用MNNG處理不能誘導ERα-36和COX-2的表達，生理性低濃度E2不能單獨誘導COX-2的表達，可以促進ERα-36的表達，藥理性高濃度E2不能單獨誘導COX-2的表達，可以抑制ERα-36的表達。生理性低濃度E2和MNNG聯合處理后ERα-36表達增高，且COX-2的表達也增高；藥理性高濃度E2和MNNG聯合處理后不能誘導COX-2高表達，見圖2。

A、B：過表達和下調ERα-36表達的GES-1細胞株中ERα-36和COX-2表達(a：P<0.05，與GES-1組比較)；C、D：單獨或聯合用MNNG、生理性低濃度E2(0.1 nmol/L)和藥理性高濃度E2(5 μmol/L)處理正常胃黏膜細胞GES-1及其重組細胞株24 h后ERα-36和COX-2表達變化[a：P<0.05，與同種細胞同種蛋白的組中溶劑對照組(a)比較]；E、F：聯用MNNG和生理性低濃度E2處理GES-1和重組細胞株24 h后，ERα-36和COX-2表達變化[*：P<0.05，與同種細胞組中同種蛋白的溶劑對照組(a)比較]；1:GES-1組;2:過表達組；3:干擾組

圖2 不同濃度E2對ERα-36和COX-2表達的影響

3 討 論

流行病學的調查數據提示，腸化的發生，可能與E2有關。E2可通過與E2受體(ER)結合而發揮多種生物學效應。研究顯示體內的多種細胞/組織/器官(經典的E2依賴性器官，如乳腺、子宮、卵巢等；非E2依賴性器官，如胃、肝、腸、神經系統與心血管系統等)均能對E2產生信號應答[14-15]。E2信號在老年癡呆、骨質疏松癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病及某些惡性腫瘤(如乳腺癌、神經膠質母細胞瘤及胃癌等)的發生發展中發揮重要作用[14-20]。

E2介導的信號傳導途徑，近年來獲得如下進展：(1)ER包括ERα和ERβ兩個亞型；(2)ERα和ERβ可表達于細胞核和細胞膜；(3)E2介導的信號傳導包括細胞核(經典途徑)、細胞膜(非經典途徑)和線粒體途徑(mtDNA途徑)，因此E2參與執行的生物學功能(如細胞生長，分化與凋亡等)并非僅依賴于細胞核途徑；(4)除傳統相對分子質量為66×103的ERα-66(經典的ERα)外，新發現了相對分子質量為46×103的ERα-46和36×103的ERα-36兩個新亞型。ERα-66主要介導E2的細胞核信號通路(經典通路)，而ERα-46和ERα-36主要介導E2的細胞膜信號通路(非經典通路)，其中ERα-46和ERα-66同源性極強，較難對其開展特異性的研究[5,19-20]。ERα-36的分子生物學特征為：(1)其蛋白中缺少AF1和AF2功能區，其轉錄啟動子位于ERα-66基因的第一個內含子中；(2)其功能及表達不完全依賴于ERα-66，其作用機制類似于生長因子受體，可經細胞膜起始的E2信號傳導發揮生物學功能；(3)可抑制ERα-66和ER-β介導的細胞核E2途徑；(4)針對ERα-36的藥物對乳腺癌細胞生長有抑制作用[5,20-21]。

MNNG是一種可以誘導CAG腸化、不典型增生，甚至胃癌的化學物。前期實驗結果顯示，MNNG在雄性大鼠更容易誘導出腸化的動物模型。本實驗結果也證實了這個現象，提示MNNG誘導腸化的發生過程中有E2參與作用，機制不明。

COX是前列腺素類生物合成的限速酶，共有2個亞型，COX-1和COX-2，是一種膜結合蛋白質，近年研究較多，COX-2與胃黏膜腸化、不典型增生及癌變的發生有關[22-26]。編碼COX-2的基因位于人類l號染色體q25.2～q25.3,全長約8.3 kb，蛋白全長227個氨基酸[22-26]。胃黏膜發生腸化時，COX-2表達增加[22-26]。

本實驗的結果顯示，低濃度E2與MNNG作用于胃黏膜細胞株，如果ERα-36低表達，那么COX-2的表達不增加，ERα-36增加，則COX-2的表達也增加，提示ERα-36也參與了腸化的過程。

綜上所述，低濃度E2與MNNG通過ERα-36信號通路共同參與胃黏膜腸化過程。