線粒體分裂/融合在高糖誘導足細胞損傷中的作用

廖奕嬌，陳奕君，何日明，劉新輝，楊曙東△

(1.廣州中醫藥大學第四臨床醫學院腎病科，廣東深圳 518033；2.廣東省深圳市中醫院腎病科 518033)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是我國終末期腎臟病(ESRD)的第二位原發病，并且其患病率和發病率均呈現快速增長趨勢[1]。DN患者因高糖血癥而引起腎小球基底膜增厚、系膜擴張及細胞外基質增生，使腎小球高濾過、產生蛋白尿，最終由慢性腎功能不全進展為ESRD[2]。足細胞是腎小球臟層上皮細胞，其結構的損傷及功能的改變都會影響腎小球濾過膜的通透性，是評估腎小球濾過膜通透性的重要生物標志物[3]。高糖對足細胞的損傷所導致的濾過膜屏障破壞是DN產生蛋白尿的主要原因[4]。podocin作為足細胞裂孔隔膜的主要蛋白分子，是足細胞損傷的重要標志，在維持足細胞的正常形態和功能及蛋白尿發生中起重要作用[5]。

A:未分化細胞；B:對照組；C:60 mmol/L組

圖1 足細胞形態變化(×100)

近年來的研究表明，線粒體在DN發生、發展中起重要作用。線粒體是一個動態細胞器，其形態的維持依靠線粒體分裂和融合機制。線粒體分裂和融合可增加細胞應激抵抗力，分裂/融合的異常與疾病的發生密切相關[6]。然而，目前有關高糖刺激對足細胞線粒體分裂/融合影響的文獻報道甚少。本研究擬通過觀察不同濃度葡萄糖對體外培養的人足細胞線粒體分裂/融合相關蛋白的調控，以探討高糖誘導足細胞損傷的可能機制。

1 材料和方法

1.1細胞與材料

1.1.1永生化人足細胞AB8/13(英國布里斯托大學Moin A.SALEEM教授饋贈)。RPMI-1640培養基、胎牛血清(FBS)、胰島素-轉鐵蛋白-硒溶液(ITS)、雙抗及胰酶(美國Gibco公司)。抗體：足突蛋白(podocin)、線粒體融合蛋白1(mitofusion 1，Mfn1)及Mfn2(英國Abcam公司)；線粒體分裂因子(mitochondrial fission factor，Mff)、線粒體動力蛋白(MiD49，美國Proteintech公司)；視神經萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，OPA1,美國BD Biosciences公司)；二抗(CST公司)。儀器：超凈工作臺(新加坡ESCO公司)；CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司)；全自動凝膠成像和化學發光圖像分析系統(美國ChemiDocTMMP Imaging System公司)、垂直電泳儀、轉膜儀(美國Bio-Rad Laboratories公司)；酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1足細胞培養 足細胞快速復蘇后用含10%FBS、1% ITS及1%雙抗的RPMI-1640培養基于33 ℃培養箱中進行增殖。每1～2天換液1次。細胞生長融合至80%～90% 時用0.25% 胰蛋白酶[含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)]溶液消化、傳代。將一部分細胞轉移至37 ℃培養箱用含5% FBS及1%雙抗的RPMI-1640培養基誘導分化10 d后用于后續實驗。

1.2.2實驗分組 對照組：普通RPMI-1640培養基；高糖刺激組的葡萄糖濃度分別為30(30 mmol/L組)、45(45 mmol/L組)、60 mmol/L(60 mmol/L組)。刺激時間為48 h。

1.2.3蛋白免疫印跡(Western blot) 細胞分組刺激后吸除培養液，以預冷的0.01 mol/L PBS洗滌2次。加入1×細胞裂解液80～100 μL/皿并均勻覆蓋，置于冰上裂解10～15 min。用細胞刮仔細刮下細胞蛋白并吸入EP管內，離心(4 ℃，12 000×g，10 min)后將上清液轉入另一EP管；電泳、轉膜、5%脫脂奶粉室溫封閉60 min；孵育一抗、二抗，曝光顯影，圖像分析。

2 結 果

2.1足細胞形態變化 與未分化細胞相比，經過10 d分化的對照組足細胞可見足突生成(箭頭所示)。而經60 mmol/L高糖刺激48 h后足突廣泛減少甚至消失，見圖1。

A:Western blot圖；B:Western blot分析圖；1:對照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對照組比較

圖2 各組細胞podocin表達

A:Western blot圖；B、C:Western blot分析圖；1:對照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對照組比較

圖3 各組細胞線粒體分裂相關蛋白表達

A:Western blot圖；B、C、D:Western blot分析圖；1:對照組；2:30 mmol/L組；3:45 mmol/L組;4:60 mmol/L組；a:P<0.05,與對照組比較

圖4 各組細胞線粒體融合相關蛋白表達

2.2足細胞標志蛋白podocin表達的變化 Western blot結果顯示，高糖刺激可呈濃度依賴性下調podocin表達，其中60 mmol/L組足細胞podocin蛋白表達顯著下調，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，為正常對照組0.63倍，見圖2。

2.3線粒體分裂相關蛋白表達 高糖刺激可呈濃度依賴性增加線粒體分裂相關蛋白MiD49及Mff的表達。其中，60 mmol/L組與對照組比較，MiD49表達顯著上調，差異有統計學意義(P<0.05)。同時，60 mmol/L組Mff表達較對照組上調，表達水平為對照組的1.33倍，但差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.4線粒體融合相關蛋白表達 各濃度的高糖刺激對足細胞線粒體融合相關蛋白Mfn1、Mfn2、OPA1的表達均有一定下調作用。其中，30、45、60 mmol/L組均可顯著下調Mfn1表達，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4A、B。45 mmol/L組與60 mmol/L組Mfn2表達較對照組顯著下調(P<0.05)，見圖4A、C。60 mmol/L組OPA1表達較對照組顯著下調(P<0.05)，見圖4A、D。

3 討 論

DN表現的持續蛋白尿與足細胞裂孔隔膜密切相關，裂孔隔膜的完整性是腎小球濾過機械屏障的關鍵[7]。podocin是分布于裂孔膜的跨膜蛋白，起到細胞骨架連接橋梁作用，是防止清蛋白濾出的關鍵分子蛋白，但裂孔膜分子易受損害，一旦發生突變則會破壞腎小球濾過膜的完整性，產生大量蛋白尿[8]。國內外已有不少研究表明高糖環境下足細胞的增殖降低，出現podocin蛋白表達明顯下調的現象[9-11]。

線粒體的分裂與融合對其正常功能的發揮具有非常重要的作用，線粒體通過不斷活躍的分裂/融合可穩定線粒體的形態及分布[12]。線粒體融合相關蛋白Mfn1、Mfn2及OPA1等，其分裂蛋白則有MiD49、Mff等。Mfn1和Mfn2是線粒體融合的關鍵介導蛋白，Mfn1主要在融合的前期促進線粒體間的彼此結合，Mfn2則主要在線粒體融合反應的后期起作用[13]。OPA1位于線粒體內膜上，具有促進線粒體融合的功能，可使嵴連接處于關閉狀態，以維持嵴的形態[14-15]。MiD49、Mff可以募集動力相關蛋白1促進線粒體裂變，且MiD49在Mff缺失的情況下，仍可推動分裂的進行[16]。本研究用不同濃度葡萄糖對足細胞作用48 h，與對照組比較，60 mmol/L的高糖刺激可引起足細胞形態結構發生明顯變化，細胞數量顯著減少，且由實驗數據可知podocin表達明顯下調。同時，由Western blot結果可知60 mmol/L高糖可上調線粒體分裂相關蛋白、下調線粒體融合相關蛋白，表明線粒體形態調控在高糖的作用下發生了明顯的變化。

綜上所述，高糖可能通過增加線粒體分裂、減少線粒體融合誘導足細胞損傷及形態異常。該研究從線粒體形態調控的角度闡明了高糖誘導足細胞損傷的機制及可能靶點，為下一步治療藥物的篩選奠定了實驗基礎。