巨噬細胞炎癥蛋白-1α通過骨硬化蛋白抑制骨髓瘤骨病患者成骨細胞功能研究

王曉桃，何玉嬋，王航飛，陽少芳，張俊艷，高彤彤，吳春葉

(桂林醫學院第二附屬醫院血液內科，廣西桂林 541199)

骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)是多發性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)患者常見的并發癥。MBD以進行性骨質破壞、多發溶骨性病變等為特征，是MM患者致殘的主要原因。研究表明，有70%左右的患者因MBD而危及生活質量并增加死亡風險，給家庭及社會造成沉重負擔[1]。因此，深入研究MBD發生機制，可為靶向治療MBD奠定理論基礎。

MBD發生的主要機制是在骨髓微環境中，瘤細胞與骨髓基質細胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)通過多條信號通路導致破骨細胞(osteoclast，OC)活性增強和成骨細胞(osteoblast，OB)活性減弱，造成溶骨性損害，阻礙新骨生成[2-3]。本課題組的前期研究已證實，巨噬細胞炎癥蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)能激活OC，介導瘤細胞生長，并在MBD的發生、發展中發揮重要作用[4]。最新研究發現，MIP-1α有抑制OB的作用[5]，但其具體機制不明確。筆者前期研究發現，大部分MM患者骨髓中MIP-1α和骨硬化蛋白(sclerostin，Scl)水平增高，兩者呈明顯的正相關[6]，Scl是Wnt/β-catenin通路的重要抑制劑[7]，β-catenin與T細胞因子相互作用，誘導OB堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性，促進前體OB的生長和早期分化、細胞外基質成熟和礦化[8]。因此，本研究擬通過體外實驗驗證MIP-1α促進瘤細胞表達Scl，從而抑制OB的分化與成熟、細胞外基質成熟和礦化促進OB凋亡，導致MBD的發生、發展。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇來自2015年1-12月本科室新確診的6例MBD患者，其中男4例，女2例，中位年齡64歲(47～73歲)。入選病例均按照國際骨髓瘤工作組的診斷標準確診為活動性MM，如并發MBD癥狀的MM患者均需行X線片檢查骨盆、顱骨、肱骨、股骨等確診不同程度的MBD，如無MBD相關癥狀的MM患者需行全身低劑量CT或胸椎、腰椎MRI以明確有無并發MBD。所有入選患者均簽署知情同意書。細胞株：高表達MIP-1α和Scl的人骨髓瘤H929細胞(購自天津血液病研究所[6])及MBD患者BMSCs分化成熟的第3代OB為研究對象。

1.2方法

1.2.1主要試劑和儀器 胎牛血清、小牛血清、DMEM培養基、RPMI-1640干粉均購自杭州四季青公司，淋巴細胞分離液、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所第一分所)，Bradford法蛋白定量試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅染色液(美國Sigma公司)。ALP改良鈣鈷法染液(南京建成科技有限公司)；MIP-1α和Scl ELISA試劑盒(美國Gibco公司)；MIP-1α和Scl蛋白，鼠抗人MIP-1α、Scl、IL-6和ALP單克隆抗體，免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒，鼠抗人GAPDH單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術有限公司)；Annexin V FITC細胞凋亡測定試劑盒(美國R&D公司)；凝膠電泳儀、酶標儀(美國 Bio-Rad公司)，IX73 倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2.2實驗分組 實驗分5組：對照組：常規培養基培養;MIP-1α組：培養基加0.2 ng/mL MIP-1α標準品；Scl組：培養基加0.2 ng/mL Scl標準品；MIP-1α單抗(MIP-1α-Ab)組：培養基加0.2 ng/mL MIP-1α單抗;sclerostin 單抗(Scl-Ab)組：培養基加0.2 ng/mL Scl單抗。

1.2.3純化并原代培養OB并鑒定 從MBD患者髂后上棘處抽取骨髓5～10 mL，肝素抗凝，結合全骨髓培養法，用等量的PBS稀釋，按1.0∶1.5比例加入紅細胞裂解液，680×g離心20 min，去除上清液，移至無菌培養瓶中,補足完全培養基(15%胎牛血清,1%雙抗，DMEM)培養。5 d后首次換液，并在顯微鏡下觀察細胞開始變為梭形、貼壁，后每3天換液1次，待細胞長滿視野70%～80%后首次傳代，經0.25%胰酶消化，并接種于六孔板，改為OB誘導分化培養基(1×10-8mol/L地塞米松、50 g/mL抗壞血酸及10 mmol/L β-甘油磷酸)。每3天換液1次，并在顯微鏡下觀察細胞形態變化，行茜素紅染色，ALP免疫組織化學鑒定為OB后方可進行傳代培養并留做后續實驗。

1.2.4茜素紅染色鑒定并觀察鈣離子沉積結節 BMSCs分化的OB培養14 d后，換液，種至6孔板，PBS沖洗2次，4%多聚甲醛固定30 min后，再用PBS沖洗3次，用0.1%茜素紅-Tris-HCl染色30 min，PBS沖洗，干燥，封固后，倒置相差顯微鏡下觀察鈣結節。

1.2.5OB的定性檢查 改良Gomori鈣鉆法ALP染色，倒置相差顯微鏡觀察。ALP陽性細胞表現為細胞質出現棕黑色片狀顆粒。

1.2.6H929細胞傳代培養 H929細胞在含10%澳洲胎牛血清(美國Gibco公司)、5%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養基中，37 ℃、5% CO2細胞培養箱中懸浮培養。

A：BMSCs分離純化培養10 d；B：BMSCs分離純化培養14 d；C：茜素紅染色BMSCs分離純化培養14 d的OB；D：ALP染色BMSCs分離純化培養14 d的OB

圖1 BMSCs分離培養純化OB(×40)

1.2.7ELISA定量檢測H929細胞上清液中的MIP-1α和Scl水平 取對數生長的H929細胞，離心棄上清液，用無血清的RPMI-1640培養基重懸調整細胞數為1×105/mL，為防止其他細胞因子的干擾，加入終濃度為1.0 ng/mL的鼠抗人IL-6單克隆抗體，靜置4 h，以中和骨髓瘤細胞分泌的主要生長因子IL-6，棄上清液，PBS沖洗3次，按實驗分組處理細胞培養24 h后，收集各組的上清液，用MIP-1α、Scl ELISA試劑盒定量檢測各組細胞上清液中的MIP-1α、Scl水平，ELISA具體檢測方法按試劑盒說明書進行。

1.2.8各組OB活性定量檢測 OB按1×105/mL種于六孔板中培養2 d，PBS沖洗2次，根據實驗分組予以更換相應的培養液，培養3 d后棄上清液，用0.25%胰酶消化細胞，置于離心管,680×g離心10 min，去上清液，加TritonX-100裂解液1 mL，反復凍融3次(凍約30 min，融約3 min)取出樣品，按ALP試劑盒說明書配制測定管、標準管和空白管，每個管混勻后37 ℃水浴10 min，再加上顯色劑，立即混勻，用分光光度計在波長520 nm下進行比色，測定各組細胞ALP活性，并用Bradford法進行細胞蛋白標準化(按蛋白檢測試劑盒說明操作)，最后用ALP/總蛋白的值計數ALP[單位:比活性(U/mg)]。

1.2.9Western blot檢測各組細胞中的ALP蛋白的表達 按1.2.3方法鑒定OB后，取對數生長期的第3代OB按1×105/mL加入6孔培養板，按實驗分組處理細胞繼續培養24 h后，按凱基全蛋白提取試劑盒說明書提取第3代OB的總蛋白，再按BCA蛋白定量試劑盒說明書定量后于-20 ℃保存。取30 μg總蛋白行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入抗ALP(1∶500)一抗、GAPDH(1∶600)，冰箱4 ℃孵育過夜，室溫培育1 h，TBST溶液清洗3遍，每遍5 min，TBST洗膜后用ECL法顯影。條帶用Imαge J軟件分析，測定灰度值。目的條帶與對應的GAPDH條帶的灰度比值為目的蛋白相對表達水平。

1.10流式細胞儀(FCM)檢測OB凋亡率 將對數生長期的第3代OB置入10%小牛血清培養基中培養過夜，調節細胞密度至1×106/mL，按實驗分組再在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中共同培育24 h后，收集細胞約5×106個進行如下操作：用Binding Buffer洗1次，室溫804.96×g離心10 min，收集細胞；洗滌后用100 μL Binding Buffer重懸細胞，加5 μL Annexin V-FITC，避光孵育20 min，再加10 μL碘化丙啶(PI，濃度為1 mg/mL)室溫下避光孵育15 min，Binding Buffer洗滌、重懸，立即上FCM檢測，每個樣品至少檢測5×106個細胞。利用Cell Quest功能軟件進行參數獲取和數據分析。每組樣品重復3次。

2 結 果

2.1OB鑒定及傳代 原代BMSCs培養5 d換液后，即可觀察到貼壁細胞，細胞形態短小，呈長梭型，細胞之間無突起連接，培養至第10天，細胞明顯增多、變長、變大，長梭型形態更加明顯，見圖1。培養至第14天時，細胞基本鋪滿皿底，細胞排列呈螺旋狀，長梭型。經茜素紅染色發現培養14 d后的OB能見到少部分鈣離子沉淀結節，ALP染色可發現OB細胞細胞質中有棕褐色顆粒或大片狀沉淀物體，顯示 ALP 染色陽性，符合OB的特征。

2.2H929細胞上清液中MIP-1α和Scl的水平 按實驗分組檢測各組H929細胞上清液中MIP-1α和Scl蛋白水平，結果顯示，MIP-1α組上清液中的MIP-1α和Scl的水平明顯高于對照組(t=6.42、3.56，P=0.000、0.012)，MIP-1α-Ab組上清液中的MIP-1α、Scl水平明顯低于對照組(t=3.42、2.78P,P=0.001、0.012)；而Scl及Scl-Ab組中的MIP-1α水平較對照組增減不明顯(t=0.618、0.744，P=0.552、0.474)、Scl水平較對照組增減明顯(t=6.97、3.17，P=0.000、0.013)，見表1。

2.3各組OB的鈣離子沉積結節分析 運用茜素紅染色鈣離子沉積結節以檢測OB外基質成熟情況，按實驗分組干預后繼續培養至第6天，發現MIP-1α、Scl組較對照組鈣離子沉積結節減少(P<0.05)。MIP-1α-Ab、Scl-Ab組鈣離子沉積結節較對照組明顯增多(P<0.05)。但各組形態變化不顯著，見表2、圖2。

表1 各組細胞上清液中的MIP-1α、Scl水平

a：P<0.05，b：P<0.01,與對照組比較

A:對照組；B:MIP-1α組；C:Scl組；D:MIP-1α-Ab組；E:Scl-Ab組

圖2 不同組OB的鈣離子沉積結節(×40)

2.4各組OB的ALP活性 MIP-1α-Ab、Scl-Ab組的OB較對照組細胞生長快，細胞呈長梭形更明顯，有的呈纖維樣生長，細胞體積增大、而MIP-1α-Ab、Scl-Ab組的OB較對照組生長慢，細胞較短小，有的呈多角形，呈樹枝狀突起。經ALP 活性檢測試劑盒檢測后，ALP蛋白表達陽性細胞為細胞質和核均出現棕黑色顆粒。定量檢測發現MIP-1α-Ab、Scl-Ab組中OB的ALP的活性明顯高于對照組(均P<0.01)。而MIP-1α、Scl組中OB的ALP的活性明顯低于對照組(均P<0.01)，見表2。

圖3 Western blot檢測各組OB的ALP蛋白質表達

A:對照組；B:MIP-1α組:C Scl組;D:MIP-1α-Ab組;E:Scl-Ab組；F:凋亡率分析;a:P<0.05,與對照組比較

圖4 各組OB細胞的凋亡率

表2 不同組成骨細胞的鈣沉積結節

a：P<0.05，b：P<0.01,對照組比較

2.5各組OB的ALP蛋白表達水平 Western blot檢測結果進一步發現，培養至第6天發現MIP-1α、Scl組OB中ALP蛋白的灰度值較對照組表達減少，MIP-1α-Ab、Scl-Ab組OB ALP蛋白的灰度值較對照組表達明顯增多，見圖3。

2.6各組OB的凋亡率 FCM檢測顯示，MIP-1α、Scl組的OB凋亡率明顯高于對照組(t=2.19,P=0.02)，MIP-1α-Ab、Scl-Ab組的OB凋亡率明顯低于對照組(t=3.12，P<0.01)，見圖4。

3 討 論

MBD的發生、發展是多因子、多信號通路相互作用的結果，本團隊既往研究發現MIP-1α在MBD的發生、發展中有重要作用，并與Scl具有一定的關聯性。但它們之間到底如何影響并不清楚。體外研究發現高表達MIP-1α和Scl的MM細胞株H929，加入MIP-1α試劑后，H929細胞株表達更多的Scl。但當加入Scl后，細胞表達的MIP-1α并不增加，說明MIP-1α可能通過不同方式促進骨髓瘤細胞表達Scl，而Scl并不促進骨髓瘤細胞表達MIP-1α。反之運用同樣的方法，在高表達MIP-1α和Scl的H929細胞中加入MIP-1α-Ab中和MIP-1α后，細胞的MIP-1α和Scl水平均下降，而加入Scl-Ab中和Scl后，細胞的MIP-1α水平卻并不下降，這說明了抑制MIP-1α表達，也會影響骨髓瘤細胞表達Scl；而抑制骨髓瘤細胞表達Scl，則并不影響骨髓瘤細胞分泌MIP-1α。這也間接說明了骨髓瘤細胞表達Scl可能受MIP-1α調控。

MIP-1α如何促進骨髓瘤細胞分泌Scl，經檢索國內外文獻均未見明確報到。有研究報道將人骨髓瘤細胞系移植給鼠構建鼠骨髓瘤模型，發現其血漿中鼠源性Scl水平增高，說明Scl可能是由骨髓微環境產生的[9-10]。也可能是在MM患者中，骨髓瘤細胞與局灶的破骨祖細胞直接接觸、相互黏附后，通過多種途徑促進骨髓瘤細胞表達Scl[11]。也有可能骨髓瘤細胞通過多種途徑激活毗鄰的破骨祖細胞，局灶增多的破骨細胞(OC)會促進骨細胞分泌Scl增多。還有學者認為Scl是由破骨祖細胞產生的[12]，而MIP-1α是一種非常重要的OC激活因子。因而，根據上述實驗結果，骨髓瘤細胞通過自分泌或旁分泌途徑分泌MIP-1α，當MIP-1α與受體結合后，使核因子κB(NF-κB)受體激動劑配體ligand of receptor activator of nuclear factor kappa B，RANKL)表達增高，增高的RANKL與骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophages，BMM)膜上的RANK受體結合，再通過膜內部分特定區域激活下游信號通路，促進BMSCs分化破骨祖細胞增多，導致Scl增多。

Scl是SOST基因精細編碼的一種糖蛋白，是骨細胞分泌的重要信號分子，參與骨形成調節，決定骨重建過程中的骨量和結構。在MBD患者BMSCs分化OB的體外實驗中，當加入MIP-1α和Scl干預時，OB的凋亡率增加，鈣離子沉積及ALP活性均下降；而加入MIP-1α和Scl單抗干預時OB凋亡率則減少，鈣離子沉積及ALP的活性則增加，這說明MIP-1α和Scl可能抑制成骨祖細胞向OB分化、增殖，減弱細胞外基質的成熟及礦化作用，促進OB凋亡。結合上述實驗可推測MIP-1α抑制OB分化與成熟的機制可能是通過其促進骨髓瘤細胞分泌Scl來實現的。Scl是 Wnt/β-catenin信號通路抑制劑，Scl水平增高可直接減弱骨形態發生蛋白(BMP)的活性，抑制骨細胞的生成[13]，Scl還可抑制Fra-1基因表達，抑制轉錄因子AP-1的活性，從而導致APL、骨鈣素(BGP)、Ⅰ型膠原和膠原酶等基因活性下降影響骨基質的形成[14]；Scl可直接抑制Wnt/β-catenin及下游的信號通路，導致OB數量下降，骨量降低，細胞外基質成熟障礙、礦化降低。Scl還上調RANKL的表達，增加OC形成，抑制OB的分化成熟。本團隊在后續的實驗發現，在晚期MBD患者中，骨髓瘤細胞負荷較高時，骨髓瘤細胞分泌的Scl可使RhoA/ROCK1信號途徑失活。ROCK1蛋白質序列中含有Erk1/2結合結構域，當Scl抑制ROCK1時，就會暴露Erk1/2，從而啟動Bax凋亡通路，促進OC凋亡。從而導致MBD的發生、發展[15]。當加入MIP-1α和Scl單抗時，可能克服骨髓瘤細胞抑制Runx2表達，防止OB和骨細胞凋亡[16]；加入單抗后，還可降低骨髓瘤細胞分泌RANKL，直接抑制破骨細胞前體分化，從而潛在地有助于OB的功能恢復[17]。這也間接地說明MIP-1α和Scl可導致MBD的發生發展。

綜上所述，MIP-1α可通過促進MM患者的骨髓瘤細胞分泌Scl，Scl通過多種途徑抑制MM患者BMSCs向OB的分化、成熟，促進其凋亡，參與MBD的發生發展，MIP-1α和Scl單抗可促進MBD患者OB的功能恢復和數量增加，促進MBD的改善，為MIP-1α和Scl單抗治療MBD奠定基礎，但其詳細的作用途徑及具體機制有待進一步研究。