白僵菌屬分類研究進展

郭東升，翟穎妍,任廣偉,成巨龍 ,劉 云 ,安德榮

(1.西北農林科技大學 植物保護學院，陜西楊凌 712100；2.中國煙草總公司 青州煙草研究所，山東青州 262500；3.陜西省煙草公司，西安 710000；4.陜西省煙草公司 寶雞市公司， 陜西寶雞 721000)

白僵菌(Cordycipitaceae：Beauveria) 在180多年前作為家蠶病原物第一次被報道。當然，那時候人們還不叫這種病原物為白僵菌。在菌物分類還沒有發展的年代里，人們認為這種“病原物”是有害的，因為它對家蠶養殖業造成巨大打擊。現在提到白僵菌就要說明一下它是哪種白僵菌了。

1912年，Beauverie建立白僵菌屬后，白僵菌的屬內種不斷增加。目前所說的白僵菌除從智利火山灰中分離的B.vermiconia和中國青藏高原土壤樣品中分離的B.malawiensis還未發現昆蟲寄主，其余都屬于兼性死體營養型的昆蟲病原真菌。白僵菌可以存在于多種生態環境中。從現在的報道可以看到白僵菌可在土壤中[1]及植物根際存活[2]；也可以內生于植物[3]；當然，最多的是作為昆蟲病原物在昆蟲上被發現報道。白僵菌以腐生菌絲或休眠的繁殖體存在于土壤或內生于植物中，直到它在周圍的微環境中黏附到合適的寄主上[4-5]。和近似屬的綠僵菌一樣，白僵菌也是最常見的昆蟲病原真菌，擁有廣泛寄主范圍，能夠侵染超過700多個種類的昆蟲[6]。白僵菌的寄主范圍已早不局限于家蠶了，它寄主范圍內的昆蟲還包括能給農業和森林帶來巨大經濟損失的重要害蟲[7]、一些病害媒介昆蟲[8]、蟑螂[9]、蜱[10]和蜘蛛[11]。而白僵菌菌株的分離一般是利用選擇培養基或昆蟲誘餌法(如，大蠟螟誘餌法，菜粉蟲誘餌法等)從土壤或昆蟲尸體中分離出來的[12]。

昆蟲致病真菌的研究始于18世紀80年代初，主要是出于對歐洲蠶養殖業的疾病管理的需要。一開始的研究發現，白僵菌是引起蠶僵化病的病原，而進一步的研究證實，白僵菌也可能感染其他昆蟲[13-16]，這也激發了人們使用白僵菌控制害蟲的想法。但之前嘗試用昆蟲病原物來防治昆蟲的想法和實踐被逐漸發展起來的化學農藥所阻滯[4]。直到現在，原先效果好的化學農藥逐漸顯露出它的弊端：新的殺蟲藥劑更新緩慢，抗藥性昆蟲群體的擴大；化學農藥的長期使用和不合理使用對生態環境造成的破壞；最重要的是這些化學農藥最終會流向食物鏈頂端的人類。在最常見的白僵菌屬內種中，B.brongniartii和B.bassiana用于控制害蟲以保護作物和根除人類疾病的媒介，已在世界范圍內被廣泛開發和利用[17-18]。據統計，2002年到2007年，全球范圍內共有171種基于昆蟲致病真菌的產品已注冊為商業真菌殺蟲劑，其中關于白僵菌的產品有63種，占到38%[6]。

早在19世紀80年代的中國，在政府的支持下用B.bassiana控制森林病害昆蟲的面積已經達到了80～130萬hm2[19]。 2003年前后，浙江大學開發的針對茶葉害蟲中蟬和蚱蜢的白僵菌的殺蟲劑的銷售標志著白僵菌在中國的市場化[20]。在世界范圍內，如19世紀80年代的巴西、俄羅斯、捷克斯洛伐克、波蘭和19世紀90年代的古巴都有一些沒有商業化的優質白僵菌劑的生產[6]。雖然說白僵菌的應用前景一片大好，但是不得不承認它的應用仍然面臨著很多問題：白僵菌產品生產廠家多但規模小，管理模式落后，技術薄弱，防效不穩定，政府支持力度不夠大[21]。2015年起中國頒布一系列倡導生物防治和綠色防控的法令，這些法令的頒布為解決這一系列問題提供強大動力。雖然說中國生物防治的研究還不夠成熟，但這也同時代表著它還有很大的發展空間。針對白僵菌藥效不穩定的問題，混合生防菌劑的研究和新的高效菌系的篩選不失為一個好的解決方案。例如，Prabhukarthikeyan等[22]利用白僵菌和芽孢桿菌聯合防治香蕉鐮刀菌枯萎病和一些水果穿孔病，取得良好效果。但對于新種的發現，高效白僵菌菌株的篩選，依然存在以下問題：在白僵菌屬分類中白僵菌屬內種寄主范圍的混雜，形態特征的多變性影響白僵菌屬內種的分類，命名[23-24]及生防制劑的開發。例如，1989年Saccardo 在非洲阿爾及利亞的沙漠蝗蟲(直翅目)上分離出的Botrytisbrongniartii，后來在白僵菌屬的分類命名發展中被歸到Beauveriabrongniartii， 雖然說Beauveriabrongniartii的寄主范圍很廣，但至今還沒有發現它能侵染直翅目昆蟲，所以Botrytisbrongniartii這個命名就建議被保留而不是修改[25]。白僵菌屬的分類研究不僅對它的生防應用前景和生物多樣性研究具有重大意義，而且為整個菌物的多樣性研究提供了參考模板。

1 白僵菌的侵染過程

因為白僵菌有特殊的昆蟲致病機理(圖1)且寄主范圍廣[26-27]，能夠相對簡單地大量生產等優點，幾乎所有的白僵菌都有作為生防制劑防治害蟲的潛力。白僵菌不像細菌和病毒那樣，它們能夠直接穿透和破壞寄主昆蟲的皮層從而在昆蟲體內寄生，逐漸殺死寄主昆蟲[28]。侵染過程的關鍵步驟就是白僵菌可以通過自身菌絲萌發產生的壓力和分泌的可以溶解昆蟲皮層組分的酶類(如脂酶，幾丁質酶，蛋白酶等)來破壞寄主昆蟲皮層組織[29]。在白僵菌芽管萌發突破昆蟲表皮后，菌絲逐漸在昆蟲組織內擴展，在最后突破血淋巴膜后，進入血淋巴。

在血淋巴內白僵菌先以菌絲體的形式或通過小的獨立繁殖體快速擴繁。在血淋巴內吸取蟲體養分并不斷產生和釋放毒性物質，以創造出自己需要的物質。這也最終導致寄主昆蟲的死亡[30]。蟲體養分被耗盡后白僵菌菌絲突破蟲體長出，隨后發育成產孢細胞，產生分生孢子去侵染其他寄主昆蟲。

2 白僵菌的分類歷史

2.1 白僵菌的發現

對于白僵菌的發現還要追溯到18世紀初，一種病害使得意大利和法國的家蠶養殖業蒙受近乎毀滅性的打擊。1807年,意大利科學家Agostino Bassi di Lodi (1773-1856)通過對這個病害近30 a的研究[31]，于1835年發表了一篇名為《 Del mal Del segno, calcinaccio or moscardino》的文章，得出是一種微生物引起這個發生在家蠶上的病害[14-15，31]。他也是第一個定義微生物引發病害理論的人[31-33]。

2.2 白僵菌屬無性型和有性型

在過去，白僵菌屬的分類地位一直是半知菌亞門-絲孢綱-叢梗孢目-叢梗孢科-白僵菌屬。由于過去普遍認為白僵菌屬是沒有有性型而只有無性型的屬[23，34]。直到發現蟲草屬的亞洲有性型，隨后用分子系統發育證明其與白僵菌屬的密切聯系[23,35]。現在很多研究已經發現蟲草屬有性型和白僵菌屬無性型之間的密切聯系。例如，B.bassiana和C.bassiana[36]，B.brongniartii和C.brongniartii[37]，B.sobolifera和C.sobolifera[34]，B.sungii和C.scarabaeicola[35]。

白僵菌的有性型在自然狀態下很少發現，僅有少數的一些在亞洲國家被找到。例如，在日本和中國發現的C.brongniartii[38-39]；在中國和韓國發現的C.bassiana[36，40 ]；也有的，例如，C.scarabaeicola在新幾內亞被報道的同時[41]，隨后又在日本[42]、中國臺灣[43]、中國大陸[44]和韓國[45]被發現。有趣的是，近年來，一些白僵菌的有性型在南美洲被找到。這表明在世界范圍內，一些白僵菌的屬內種極有可能存在完整的生活史或者有些被發現物種的全型可能包含某些白僵菌的無性型階段[46]。對于以前的白僵菌屬的分類結果，現在已經逐步開始用分子系統發育重新進行劃分。由于白僵菌屬有性型的發現和分子系統發育結果的支持。最終根據Kirk[47]的結果，從 NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上可以看到，現在的白僵菌屬已被劃分到子囊菌門-子囊菌綱-肉座菌目-蟲草菌科內。

圖1 白僵菌的侵染過程Fig.1 Infection process of Beauveria(From http://www.anatisbioprotection.com)

2.3 以形態學特征為主要分類標準的白僵菌分類歷史

在以形態學特征作為白僵菌屬內種主要劃分依據的時代里，關于白僵菌的命名和屬內劃分一直是沒有明確定論的。在白僵菌屬的分類歷史中，它有過許多不同的名字。如，Botrytis，Sporotrichum和Isaria，同時也被認為是其他屬的無性型[48-50]。

第一個給白僵菌命名的人是Balsamo-Crivelli，在1835年為了紀念白僵菌的發現者Agostino Bassi di Lodi，隨將其命名為BotrytisbassianaBals.-Criv[51]。而真正建立白僵菌屬的人則是Beauverie。在1911年，Beauverie指出該白僵菌應屬于一個尚未被描述的新屬，1912 年Vuillemin 以Botrytisbassiana為模式標本將該菌的屬名定為白僵菌屬(GenusBeauveria)，為了認可Beauverie在該屬上的巨大貢獻，在1914年將Botrytisbassiana更名為Beauveriabassiana[23,51]。

白僵菌屬建立后，有很多菌物學家通過培養特性和形態學特征對白僵菌屬進行屬內分類研究。1926年，Petch對先前被認為是白僵菌屬內8個近似種的樣本進行分類研究，結果通過孢子形態特征將這8個種分成B.bassiana和B.densa(Link) F. Picard 2個種[52]。1954年，MacLeod 通過對白僵菌屬內16個近似種的培養特性和形態學特征研究，最終確定2個種B.bassiana和B.tenella。這2個種之一的B.tenella是對Petch命名屬B.densa的修改[49]。1972年，De Hoog向外界發表他對于白僵菌的各個研究方向的研究成果，其中包括他個人總結的白僵菌屬間劃分的關鍵識別特征。他像Petch和MacLeod一樣將白僵菌屬內劃分為2個種，不同的是用B.brongniartii代替B.densa和B.tenella。1978年，在先前的基礎上，De Hoog根據他的研究結果又增加1個B.alba，不過隨后De Hoog又將其劃分到Engyodontium[50]。1975年，De Hoog和Rao從智利火山灰分離出孢子形態為逗號狀的B.vermiconia[1]。1982年，Samson 和Evans從厄瓜多爾的鱗翅目幼蟲上分離出孢子形狀為橢圓形且孢子表面帶有粘性膠質層的B.velata[53]，隨后他們又從巴西鞘翅目昆蟲上分離出孢子形狀為圓柱形的B.amorpha[53]。1988年，Bisset和Widden從新西蘭沼澤地土壤中分離出孢子形狀為短圓柱狀的B.caledonica[54]。2006年，Rehner等在這些基礎上又從馬拉維雙斑弗天牛/桉嗜木天牛上分離出孢子形狀為圓柱狀的B.malawiensis。截至2018年1月10日，已報道的白僵菌屬內種共有18種，它們的具體形態學特征見表1。

3 形態學特征在白僵菌屬內種鑒定中的局限性

利用形態學特征可以很容易地在屬的層面上識別白僵菌。白僵菌的分生孢子梗無隔膜，由輪生、致密、透明、細胞壁平滑的產孢細胞團簇組成；產孢細胞合軸分枝，短球狀或長頸瓶狀；軸頂為人字形，表面呈鋸齒狀，在上面可見一連串無色，透明，全分裂的分生孢子[25,50]。在培養過程中，白僵菌一般生長緩慢，菌落表面有綿毛狀物。很少形成菌絲束，白色或淡黃色，偶有粉紅色。氣生菌絲透明，細胞壁薄且光滑，松散，有時叢生。由于白僵菌可產生大量的球形、近球形和橢圓形到圓柱形等形狀不一且可變形的[55]分生孢子，老熟菌落表面呈粉狀[24,50]。還有一些白僵菌的屬內種能夠分泌色素，例如，在一些培養基中產生紅色的二苯醌卵胞素[50,56]。值得一提的是，1994年，Eyal從B.bassianaNov. EO-1 菌株上分離的紅色色素對植物昆蟲(如，粉虱)和土壤昆蟲(如，橡皮蟲)有很高的毒力，具有很好的防治一些害蟲的前景[57]。

在過去的近2個世紀里，盡管有研究證明分生孢子形狀可能隨著培養而改變[55]。培養特性和分生孢子的形狀、大小依然是識別、鑒定白僵菌并進行屬內分類的主要方法。可隨著研究的深入，白僵菌屬孢子形狀大小的重疊，缺乏特征性識別特征的問題逐漸凸顯出來，這也導致一些種的誤判或者把一些種錯誤地歸到更大范圍的類群[49,58]。因此，白僵菌屬的形態學分類存在的這些問題降低了它在白僵菌屬內分類的有效性。到目前為止只有從智利火山灰中分離出的B.vermiconia的逗號形狀的分生孢子與白僵菌屬內其他種的分生孢子形態差異巨大，可以用形態學分類來準確區分。

在2005年后，隨著一些形態學相似但分子系統發育相差甚遠的種和一些神秘種的發現[23-24,59-60]讓人們意識到：傳統的分類方法在白僵菌屬內的分類應用上顯得越來越不方便，不準確；菌物的分類在分子時代正面臨著變革，白僵菌屬正是其中不可或缺的一員[4]。

4 白僵菌屬的分子生物學鑒定

4.1 探索階段的白僵菌屬的分子時代分類史

1989年，Mugnai等運用白僵菌的主要生物化學成分對白僵菌屬內種進行分類[61]并從B.bassiana復合種里成功分出B.alba。并鑒別出B.alba，B.amorph，B.bassiana，B.brongniartii，B.velata，B.vermiconia。在這之后，陸續也有對白僵菌生物化學成分進行研究的報道[55,62-63]。這些報道對于白僵菌孢子和菌絲的代謝路徑研究以及白僵菌生物防控的優化是具有重要意義的，但是作為白僵菌種間劃分的依據還不夠精確。現在關于白僵菌屬劃分依據更多倡導多基因位點分子系統發育的鑒定方法。從19世紀開始分子生物學技術就已經運用到白僵菌的分類研究中。如，DNA探針技術[64]，隨機擴增片段多態性(RAPD)技術[65]，單鏈形態多態性(SSCP)技術[66]，端粒指紋技術[67]，限制性片段長度多態性 (RFLPs) 技術[68]，擴增片段長度多態性 (AFLPs)技術[69]，序列特異擴增區域(SCAR)技術[70]，簡單序列重復多態性(SSR)技術[71]，線粒體DNA 技術和簡單序列重復區間(ISSR)技術[72]等。現在看來這些技術沒有在白僵菌的分類研究中建立權威的標準分類模式，但卻成功地應用到白僵菌在環境土壤中接種釋放后的持續和可追溯性評估中[72-73]。另外，這些技術還成功運用于對一些真菌群體結構特征[74]、基因多樣性[75]或者一些自然狀態下特異真菌種群的發生[76]等方面的研究。

隨著分子技術的不斷革新與進步，白僵菌的屬內很多根據形態學特征劃分的種到現在被證明包含一些獨立親緣關系的種[23-24]。因此，根據形態學特征的分類已不足以評估白僵菌的生物多樣性了。慶幸的是，面臨的問題正驅使菌物學家們探究，提議更多更好的可選擇方案來更加精確地劃分白僵菌的屬內種，而絕不是僅僅通過形態學特征來劃分屬內近緣種[24,77]。

4.2 核糖體轉錄間隔區ITS

真菌中，核糖體轉錄區從3′到5′端依次是18S小亞基(SSU)、5.8S、28S大亞基(LSU)。轉錄間隔區從3′到5′依次是ITS1和ITS2，被5.8S區段分開。由于核糖體DNA的ITS區域變異水平高，而轉錄區域比較保守[78]；測序花費比較低；引物在所有真菌里基本通用，容易擴增且測序方便。所以是目前應用最廣泛的分子系統發育研究位點[79-81]。自20世紀90年代以來，ITS-rDNA區域是真菌鑒定和分子分類學上最常見的遺傳標記，近年也成為真菌研究的常用DNA條碼[79-80,82]。然而，僅以ITS區域作為真菌屬種間劃分依據，已經被許多菌物學家所詬病；因為它沒有足夠的變異度來解決一些——諸如，白僵菌和綠僵菌等相近物種間的區分[23,83-85]——問題。另外，在白僵菌的屬內種的區分上，近年來，很多報道也強調僅用核糖體ITS序列也是遠遠不夠的[71,86]。如，在Imoulan等的報道中，白僵菌屬內，只有ITS序列差異大的種僅能用ITS序列來區分 (如，B.bassiana,B.hoplocheli,B.malawiensis,B.sungii,B.sinensis,B.amorpha,B.caledonica,B.vermiconia,B.varroae,B.kipukae和B.lii)，這也間接說明單獨特定片段的DNA條碼的功能是有一定限度的。

4.3 轉錄延長因子EF-1a(TEF)

在2005年，TEF首次被Rehner 和 Buckley應用在一項區分分子系統發育不同的白僵菌屬內種的綜合研究中，隨后的類似研究均把該位點作為一個優質位點多次采用[11-12,23-24,58,71,86-88]。在2005年的這篇論文中，5個與它們之前的形態學特征描述密切相關的種被劃分出來[71]。其中，廣義B.bassiana分生孢子有球形和亞球形，它的分子系統發育不是單一的，是由2種不相關的，但形態上無法區分的2個譜系組成，分別位于2個不同的分支A和C上，所以被認為是2個獨立的種。分支A在全球范圍內分布，與狹義B.bassiana，以及與分支C密切相關，分支C中包含與分支A形態學特征不同的菌株。后來被鑒定定名為B.pseudobassiana[24]。分支B包括B.brongniartii的分離物，這是一種分生孢子為橢圓形的歐亞物種。分支D種有兩種，B.caledonica和B.vermiconia，分別產生圓柱形和逗號形狀的分生孢子。分支F由孢子形狀為圓柱形的B.amorpha組成[23]。

在這之后又有報道說明，由于狹義B.bassiana和B.pseudobassiana兩者的TEF序列對比差異太小，它們的區分僅通過TEF序列數據的話是不準確的[23-24,59]。在分析2個來自摩洛哥和中國種的數百個樣品后，發現兩者的差異最顯著的地方是，氣生菌絲在產生分生孢子階段一個是灰白色，一個是黃褐色，從而導致它們的菌落顏色不一[89]。

4.4 多基因位點分析

在系統發育學科興起以來，人們逐漸認識到，在真菌中用某物種的單基因位點的譜系來反映整個物種的系統發育過程是沒有代表性的[90]。通過分析不同的單個基因位點推斷出的系統發育結果可能是矛盾或是拓撲的結果。另外，已有理論研究表明，多基因聯合分析可以對單基因分析產生的結果有實質性的補充改進[91]。因此，為了更準確地提供真正的系統發育關系，近年對于物種間的差異性研究，多使用多基因位點聯合分析方法[92]。同樣的，許多研究認為通過組合一個物種內相對多的基因位點聯合分析可以提高物種的界定和識別的準度。在菌物中，采用綜合的多位點基因條碼的方法來識別和界定物種已經成為趨勢[5,24,91,93]。菌物分類學家們也通過自己的實驗探究和同行間的交流，總結出菌物多基因位點分析系統實施的可靠方案，以此劃定和鑒別一些神秘物種，并避免對一些物種的錯誤識別[24,60,85,94]。

在一些可選擇的分子標記[如，RNA聚合酶Ⅱ大亞基基因(RPB1)，RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基基因(RPB2)，轉錄延長因子1a基因(TEF)，核基因間隔區block(bloc)]已經被成功的應用來處理白僵菌屬內復雜的種間劃分問題[24,60]。bloc是專門為鑒定非洲新熱帶的廣義B.bassiana系統發育起源設計的[60]。之后bloc被用作單基因位點成功地劃分出B.malawiensis[60]。在這之前，Rehner用TEF和ITS兩個基因位點對白僵菌屬內進行分子系統劃分[23]。RPB1和RPB2也經常和一些其他不同的基因(例如,nucSSU,nucLSU和5.8S)聯合起來，用于分析解釋菌物分類的系統發育關系[5,60,95-96]，其中包括白僵菌[24]。

2011年，Rehner用以上所描述的4個基因位點對從不同地理位置，棲息地和寄主所取的68株白僵菌樣本進行種的劃分[24]。結果用這個方法劃分出12種白僵菌(B.bassiana，B.australis，B.kipukae，B.pseudobassiana，B.varroae，B.brongniartii，B.asiatica，B.sungii，B.amorpha，B.caledonica，B.malawiensis和B.vermiconia)。隨后又有新種被陸續報道，如，B.lii[12]，B.sinensis[87]，B.rudraprayagi[88]，B.hoplocheli[58]。還有最近報道的新種，從中國青藏高原分離的B.medogensis[86]，從中國貴州分離的B.araneola[11]。所以，到現在白僵菌的屬內種增加到18個。自2011年后，這6個新種的發現和界定主要也是依靠多基因位點的聯合分析的結果。整理所有通過多基因位點DNA條碼的方法鑒定且報道的白僵菌的種(圖2),然而結合圖3可知，有些不同種的白僵菌分享著相同的孢子形狀，但是分子系統發育分析結果卻相差很大。如，2011年Rehner等，利用分子系統發育的方法在廣義B.bassiana里分出3個種(B.varroae，B.pseudobassiana和B.kipukae)；從廣義B.brongniartii里分出2個種(B.asiatica和B.australis)。

a-f.長橢圓形或圓柱形分生孢子。a.B.lii; b.B.amorpha; c.B.sinensis; d.B.hoplocheli; e.B.malawiensis; f.B.caledonica. g-i.橢圓形分生孢子。g.B.asiatica; h.B.sungii; i.B.brongniartii. j-p,R.球形或亞球形分生孢子。j.B.australis; k.B.bassiana; l.B.kipukae; m.B.varroae; n.B.pseudobassiana; o.B.medogensis; p.B.rudraprayagi. R.B.araneola. q.B.vermiconia.比例尺：10 μm，*表示比例尺不可用。

a-f.Beauveriaspecies with elongate ellipsoidal to cylindrical conidia; a.B.lii; b.B.amorpha; c.B.sinensis; d. B.hoplocheli; e.B.malawiensis; f.B.caledonica. g-i.Beauveriaspecies with ellipsoidal conidia, g.B.asiatica; h.B.sungii; i.B.brongniartii. j-p, R.Beauveriawith globose to sub-globose conidia, j.B.australis; k.B.bassiana; l.B.kipukae; m.B.varroae; n.B.pseudobassiana; o.B.medogensis; p.B.rudraprayagi.Beauveriawith comma-shaped conidia, R.B.araneola, q.B.vermiconia(Rehneretal. 2006,2011; Chenetal. 2013; Zhangetal. 2012; Agrawaletal. 2014; Imoulanetal. 2016b; CHEN W Hetal. 2017). Scale bars: 10 μm, * indicates scale bar not available.

圖218種已被鑒別白僵菌的分生孢子形態
Fig.2ConidiashapeoftheseventeenrecognizedBeauveriaspecies

引導值(p50%)和后驗概率(=100%)被標記在分支上并被“/”分隔開。分支末端的ARSEF標記是Rehner 2011年報道中分離的單個菌株的登入號。除了RCEF5500, RCEF3903, Bt98, Bt121, Bt128 ,strain2898 和GZU0317。這些是2011年后新發現種的登入號(Zhang等,2012; Chen等,2013; Robène等,2015; Imoulan等,2016; CHEN W H等,2017)。

Bootstrap values (P50%) and posterior probabilities (=100%) are labeled above branches and separated by “/”.Terminal clades are labeled according to ARSEF accession numbers of individual isolates reported in Rehneretal. (2011), except RCEF5500, RCEF3903, Bt98, Bt121, Bt128 ,strain2898 and GZU0317, which are newly accession number of those discovered species after 2011. (Zhangetal. 2012; Chenetal. 2013; Robèneetal. 2015; Imoulanetal. 2016; CHEN W Hetal. 2017).

圖3運用TEF1,RPB1,RPB2和Bloc多基因位點聯合分析的方法，基于最大似然法和貝葉斯定律對于白僵菌屬內的18個種建立的系統發育樹
Fig.3Phylogenetictreeof18BeauveriabasedonMaximumparsimonyandBayesianinferenceofcombinedTEF1,RPB1,RPB2andBloc

多基因位點分子系統發育分類得到的結果比形態學分類得到的結果更能反映白僵菌屬的生物多樣性[24,60]。這些研究證明多位點DNA條碼的方法在分析和鑒定未知的白僵菌上的前景，也為其他與白僵菌屬相類似的屬的分類提供參考依據。

5 孢子形狀

自從1912年Vuillemin建立白僵菌屬，現在共有18個屬內種用多基因位點聯合分析的方法被劃分出來。根據分生孢子的形態 (表1，圖3)，白僵菌屬內主要被劃分為4個類群。第1個類群中包含6個種：B.amorpha，B.caledonica，B.malawiensis，B.lii，B.sinensis和B.hoplocheli(圖3-a～3-f)，它們的分生孢子形態是加長的橢圓形或圓柱形。第2個群體包含3個種:B.brongniartii，B.asiatica和B.sungii，它們分生孢子的形態是橢圓形 (圖3-g～3-i)。第3個群體包含8個種:B.bassiana，B.australis，B.kipukae，B.pseudobassiana，B.varroae，B.rudraprayagi，B.medogensis和B.araneola(圖3-i～3-p,3-R)，分生孢子形態是球形到亞球形。第4個群體包含1個種:B.vermiconia(圖3-q)，分生孢子形態是逗號形。

6 總結和展望

總的來說，白僵菌屬內分類混亂的問題給白僵菌的生物多樣性及其應用研究帶來很大問題和挑戰，而分子系統發育的方法是解決這一問題的有效手段。如，在應用白僵菌的過程中很多人會認為白僵菌是不是會感染家蠶，從而在控制其他害蟲的同時對家蠶養殖業造成打擊。Wang等[97]通過研究中國西南部家蠶養殖業病原白僵菌的多樣性，發現家蠶養殖業中的病原白僵菌和生防所用的病原白僵菌分子系統發育差異較大，是不同的種類。從而在一定程度上推廣了白僵菌的應用。

由于白僵菌屬的分生孢子形態的重疊，導致該屬缺乏精確的形態學識別特征。如，之前用傳統的形態學分類方法只劃分出2個種B.bassiana和B.brongniartii[49,50,52]。所以，僅用形態學特征進行分類的方法被認為是不準確的。

在大規模DNA測序技術問世之前，傳統的形態學分類方法一直缺乏批判性的觀點[23-24]。但是僅用ITS序列這一單一的基因位點，在一些種的分類上是沒有代表性或者說是不合適的。現在，白僵菌屬內劃分采用的是除形態學以外，聯合ITS的多基因位點或ITS以外的單或多基因位點分析的方法。多基因位點聯合分析的方法也被許多菌物學家提倡作為種間或種內劃分的有效工具[24,86]，也是識別鑒定隱含種極其有效的工具[98]。

一直以來，分生孢子形態是絕大多數菌物的屬內種的形態學劃分依據，也是比較有效的劃分依據。可隨著學科的發展，發現在白僵菌屬中用分生孢子特征進行白僵菌屬內分類的方法是不夠準確和全面的。所以在白僵菌屬內和其他的菌物屬內，分生孢子形態更多的是作為菌物分類中最重要的形態學特征扮演著輔助分子系統發育，從而精確劃分種的角色。

目前，已經有18個白僵菌的種通過多基因條碼的方法被劃分出來。然而在index of fungorum(www.indexfungorum.org; 2018-01-10)上可以看到61種關于白僵菌的分類命名，其中尚有43種有待通過多基因條碼來驗證。

分子系統學分類方法可以通過發現白僵菌新種和了解它們的地理分布[99]，從而共同增加現有的白僵菌的生物多樣性，進而拓展白僵菌的應用。同樣的，一些其他用于多基因位點聯合分析的有效位點的增加也會極大地幫助人們對白僵菌基因結構的全面理解，當然也會為種的識別和劃分提供有力的幫助。另外，新一代基因測序技術(NGS)出現后已經在一些研究中得到應用，它能夠快速測序整個基因組，并增加所測序目標區域的深度。這個新技術的出現，使研究者在整個基因組層面上做分子系統發育成為可能[100-101]。這種新技術的出現將顯著改變菌物分類學家們分析和研究白僵菌以及其他真菌群之間進化關系的方式。

致謝:首先感謝實驗室的陳雅寒師姐，李曉宇師姐，程睿君師姐，邱珂師姐和汝冰璐師兄給予的支持。其次要特別感謝孫廣宇老師，張榮老師，江聰老師和梁曉飛老師提供的幫助。最后還要感謝原晨虹同學給予的鼓勵和對論文完成的幫助。