禽流感病毒三種病原學檢測方法的比較研究

陳弟詩，陳斌，章健，邱明雙，鄧飛，王澤洲

（1.四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041；2.成都微瑞生物科技有限公司，四川 郫都 611731）

禽流感病毒（AIV）為正粘病毒科甲型流感病毒屬，單股負鏈RNA病毒。依據(jù)其外膜血凝素（H）和神經(jīng)氨酸酶（N）蛋白可分為H亞型和N亞型，目前已發(fā)現(xiàn)18個HA和11個NA亞型［1］。已報道能感染人類的禽流感病毒有H5［2］、H7［3］、H9［4］等亞型。其中H5、H7為高致病性亞型，潛伏期短，大多無臨床癥狀而突然死亡，發(fā)病率和致死率極高［5-6］；H9為中低致病性亞型，幾乎所有的養(yǎng)禽場均存在［7］，各型禽流感還可與其他病原混合感染，導致禽病復雜化。禽流感不僅危害養(yǎng)禽業(yè)，也嚴重威脅人類健康，影響國際貿(mào)易。因此，研發(fā)、篩選和使用快速準確的臨床檢測方法對于禽流感的防控具有重要意義［8］。目前，禽流感診斷方法較多，國標方法有雞胚培養(yǎng)分離法、血凝和血凝抑制試驗、瓊脂凝膠免疫擴散試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、RT-PCR、熒光定量RT-PCR，以及農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的免疫酶滲濾（Dot-ELISA）法和膠體金免疫層析試紙條法［9］，這些方法各有優(yōu)缺點和適用范圍。本試驗主要選用了目前已商品化的禽流感病原高敏快速熒光免疫法、膠體金免疫層析紙條法和實時熒光RT-PCR法進行研究，對比這三種方法在臨床快速診斷中的實用性，為禽流感病毒檢測提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 禽流感病毒 H5、H7和H9亞型血凝抑制試驗抗原，均購自哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.1.2 試劑 禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測試劑盒由成都微瑞生物科技有限公司提供；禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒（通用型）購自哈爾濱國生生物科技股份有限公司；國產(chǎn)禽流感病毒抗原檢測卡購自國內(nèi)某生物股份有限公司，進口禽流感病毒抗原檢測卡購自韓國某公司。

1.1.3 主要儀器 WellrayRWR-1608熒光儀，由成都微瑞生物科技有限公司生產(chǎn)；熒光定量PCR儀CFX96，由美國BIO-RAD公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 檢測樣品的制備 將禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型血凝抑制試驗抗原分別用0.1 M PBS 按 2-2×10-1（1∶40）、2-3×10-1（1∶80）、2-4×10-1（1∶160）……2-12×10-1（1∶40 960）稀釋成12個梯度系列，備用。

1.2.2 高敏快速熒光免疫法 使用禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測試劑盒分別對禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型抗原的12個稀釋度樣品進行檢測，每個稀釋度做一個重復。用微量加樣槍吸取80 μL檢測樣品，按稀釋梯度有序加入試劑卡加樣孔，靜置15 min后，將檢測卡依次放入WellrayRWR-1608熒光儀讀數(shù)，通過微瑞生物云平臺手機APP直接得出判定結果：T/C值大于0.6，被檢樣品判為陽性。

1.2.3 免疫層析法（膠體金試紙條） 使用國產(chǎn)和進口兩種禽流感病毒檢測卡分別對禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型抗原的12個稀釋度樣品進行檢測，每個稀釋度做一個重復，并設置陰性對照。用微量加樣槍吸取80 μL檢測樣品，按稀釋梯度有序加入檢測卡加樣孔中，加樣完成后靜置，5～30min內(nèi)觀察結果。肉眼觀察試紙條上的質控線（C線）和檢測線（T線），當C線和T線同時出現(xiàn)條帶時，被檢樣品判為陽性。

1.2.4 熒光定量RT-PCR法 使用禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒（通用型）分別對禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型抗原的12個稀釋度樣品進行檢測。按試劑盒說明書操作，采用柱式RNA提取法分別對三種亞型12個稀釋度樣品的RNA進行提取。反應擴增條件為：第一階段，反轉錄50℃ 30 min；第二階段，預變性95℃ 3 min；第三階段95℃ 15 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，熒光信號采集設置在第三階段退火時進行。結果判定：Ct值小于35時，被檢樣品判為核酸陽性。

2 結果

2.1 高敏快速熒光免疫法 禽流感病毒H5亞型抗原樣品：2-2×10-1至2-8×10-1稀釋度為陽性，表明禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測試劑盒最高可檢出稀釋度為2-8×10-1（1∶2 560）的H5亞型樣品；禽流感病毒H7亞型抗原樣品：2-2×10-1至2-7×10-1稀釋度為陽性，表明該試劑盒最高可檢出稀釋度為2-7×10-1（1∶1 280）的H7亞型樣品；禽流感病毒 H9 亞型抗原樣品：2-2×10-1至2-6×10-1稀釋度為陽性，表明該試劑盒最高可檢出稀釋度為2-6×10-1（1∶640）的H9亞型樣品。

2.2 膠體金免疫層析法

2.2.1 某國產(chǎn)禽流感病毒檢測卡 陰性對照可肉眼觀察到控制線（C線）出現(xiàn)明顯條帶，檢測線（T線）也呈現(xiàn)出很弱的條帶，故無法準確判定結果（圖1）。

圖1 某國產(chǎn)禽流感膠體金免疫層析檢測卡

2.2.2 某進口禽流感病毒抗原檢測卡 陰性對照可肉眼觀察到只有控制線（C線）出現(xiàn)明顯條帶。禽流感病毒H5亞型抗原樣品在2-2×10-1至2-8×10-1（1∶2 560）稀釋度，檢測線（T線）出現(xiàn)明顯條帶（+++），到2-11×10-1（1∶20 480）稀釋度，條帶表現(xiàn)弱陽性（+）（圖2）；禽流感病毒H7亞型抗原樣品在 2-2×10-1至 2-4×10-1（1∶160）稀釋度，檢測線（T線）出現(xiàn)明顯條帶，到2-5×10-1（1∶320）稀釋度，條帶表現(xiàn)弱陽性（圖3）；禽流感病毒H9亞型抗原樣品在 2-2×10-1至 2-7×10-1（1∶1 280）稀釋度，檢測線（T線）出現(xiàn)明顯條帶，到2-10×10-1（1∶10240）稀釋度，條帶表現(xiàn)弱陽性（圖4）。3種亞型樣品的條帶顏色均是隨稀釋度的升高而減弱。

2.3 熒光定量RT-PCR法 本次試驗方案設定的禽流感病毒H5、H7和H9三種亞型最高稀釋度2-12×10-1（1∶40 960）樣品的CT值均小于試劑盒中陽性判定值35，且有典型的曲線，判定為陽性（圖5、圖6）。表明禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒（通用型）對H5、H7和H9三種亞型病原的檢出靈敏度均高于稀釋度2-12×10-1（1∶40960）。

圖2 進口通用抗原檢測卡對H5亞型梯度稀釋的檢測結果

圖3 進口通用抗原檢測卡對H7亞型梯度稀釋的檢測結果

2.4 三種檢測方法的結果比較 將三種方法的檢測結果進行比較，可以發(fā)現(xiàn)：（1）禽流感病毒熒光RT-PCR檢測試劑盒（通用型）的檢測靈敏度是三種方法中最高的；（2）禽流感病毒高敏快速熒光免疫檢測試劑盒對H5亞型禽流感抗原的靈敏度為2-8×10-1（1∶2560），比對H7亞型高2倍，比對H9亞型高4倍；（3）某進口禽流感病毒抗原檢測卡（膠體金免疫層析法）對H5和H9亞型的靈敏度達2-11×10-1（1∶20 480）和2-10×10-1（1∶10240），而對H7亞型的靈敏度僅為2-5×10-1（1∶320），對H5的靈敏度是H7的64倍，對H9的靈敏度是H7的32倍（表1）。

圖4 進口通用抗原檢測卡對H9亞型梯度稀釋的檢測結果

圖5 H5亞型抗原梯度稀釋熒光RT-PCR試劑盒檢測結果

圖6 H7亞型抗原梯度稀釋熒光RT-PCR試劑盒檢測結果

表1 三種方法檢測已知禽流感陽性抗原的結果比較

3 討論

3.1 本試驗中禽流感高敏快速熒光免疫法對禽流感三種亞型抗原的靈敏度較一致，能檢出亞型的最低稀釋倍數(shù)達2-6×10-1（1∶640），且能準確讀數(shù)，可見該方法能作為實驗室確診病原的有效方法。高敏快速熒光免疫法是近幾年發(fā)展成熟的一種高敏感性和高特異性的新檢測方法，既具有膠體金免疫層析法簡單、方便、快捷等優(yōu)點，又具有PCR法的準確、特異、敏感等優(yōu)點，同時以云平臺為基礎，形成了禽流感“現(xiàn)場移動檢測+即時診斷+遠程數(shù)據(jù)分析”的新檢測模式［10］，該方法適用于現(xiàn)場即時檢測（POCT），可在基層獸醫(yī)部門、養(yǎng)殖場等推廣應用［11］。

3.2 本試驗同時選用了國產(chǎn)和進口的膠體金免疫層析試紙條進行比較，發(fā)現(xiàn)該類市售產(chǎn)品質量參差不齊，特別是國產(chǎn)產(chǎn)品存在假陽性、準確性較差、誤診率高的缺點；某進口試紙條對H5、H9亞型禽流感敏感性高，但對H7亞型靈敏度較差，臨床上容易造成H7亞型的漏檢。而影響該類產(chǎn)品敏感度的因素很多，主要包括捕獲抗體、結合抗體的特異性，包被量、墊和膜材料選擇、膠體金顆粒大小濃度，緩沖體系的選擇使用等。因此，在選擇和使用膠體金免疫層析試紙條時進行比對驗證是非常必要的。由于不同廠家產(chǎn)品的檢測體系不同，選用的緩沖液也不同，在實際檢測過程中需嚴格按照各廠家說明書，使用原廠配送的緩沖液進行檢測，以提高準確性。

3.3 本試驗設定的三種禽流感病毒亞型樣品最高稀釋度2-12×10-1（1∶40 960）均未達到實時熒光RT-PCR試劑盒的檢測下限。表明實時熒光RTPCR法具有靈敏度高、特異性好、準確性高等特點，但該方法操作繁瑣、容易污染，且靈敏度和準確性還取決于前期樣品RNA的提取，需要專門的儀器和專業(yè)技術人員，大批量檢測時還需要其他配套設備，費力、費時、費錢，因此僅適合用于專業(yè)實驗室檢測。

4 結論

通過以上三種方法的比較，可知實時熒光RT-PCR法的靈敏度最高，從分子角度的準確性也最高，但檢測所需時間最長；膠體金免疫層析試紙條檢測雖然耗時少，操作極簡，但漏檢和假陽性的可能性高，且對禽流感三種亞型抗原的檢測下限相比其他兩種方法均無顯著優(yōu)勢；高敏快速熒光免疫法的檢測靈敏度比實時熒光RT-PCR低，但迅速簡便，可達到快速診斷的目的。

高敏快速熒光免疫法和膠體金免疫層析試紙條法適合用于臨床大量樣品的初步篩選；高敏快速熒光免疫法還可進一步用于基層獸醫(yī)實驗室的初篩；實時熒光RT-PCR法則適合對禽流感可疑病例的確診。在流行病學調查中，可采用高敏快速熒光免疫法或膠體金免疫層析法進行現(xiàn)場檢測，既減少檢測時間和工作強度，又提高檢測結果的準確性。