靶向四次跨膜L6家族成員1通路抑制三陰性乳腺癌干細胞自我更新的研究

張偉杰，薛 磊，馬志俊，李冬薈，王留興

(鄭州大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州450052)

近年來乳腺癌的發(fā)病率在世界各國均處于上升趨勢，預計2020年美國女性乳腺癌患者將有276 480例，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%，居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，死亡42 170例(12%)，居女性惡性腫瘤死亡率第2位[1]。2019年國家癌癥中心最新數據顯示我國2015年乳腺癌居女性惡性腫瘤發(fā)病率第1位(占比17.10%)，死亡率居第5位(占比8.16%)[2]。三陰性乳腺癌例數約占乳腺癌總例數的10%～20%，三陰性乳腺癌多呈浸潤性生長，惡性程度偏高，易復發(fā)和多器官轉移，預后較其他分子分型差，三陰性乳腺癌除了化療外無有效治療手段，目前國內外對三陰性乳腺癌的治療手段無突破性研究進展。腫瘤組織中其實只有很小一部分細胞具有引起腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、保持腫瘤異質性的能力，被稱為腫瘤干細胞，其與腫瘤起源、復發(fā)與轉移、耐藥密切相關，乳腺癌亦是如此[3]。

為了尋找乳腺癌干細胞潛在的治療靶點，前期研究中我們利用流式細胞儀分選出CD44+CD24-/low乳腺癌干細胞，基因芯片和測序分析乳腺癌干細胞和普通乳腺癌細胞兩者差異表達的基因，結果發(fā)現與普通乳腺癌細胞相比，四次跨膜L6家族成員1(transmembrane 4 L6 family member 1，TM4SF1)在乳腺癌干細胞中顯著高表達。本課題組前期研究[4]同時發(fā)現TM4SF1在乳腺癌組織中比癌旁組織及正常乳腺組織明顯高表達，并且分化程度越低、分期越晚，TM4SF1表達水平越高；其中三陰性乳腺癌組織TM4SF1蛋白陽性表達率最高。這些結果都提示TM4SF1參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉移。

本研究旨在探討TM4SF1在三陰性乳腺癌干細胞中的作用以及通過靶向TM4SF1抑制其自我更新的可能性，分析該通路作為三陰性乳腺癌干細胞新的治療靶點的可行性，為下一步研究提供新的理論和思路，對三陰性乳腺癌具有潛在的治療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系購自中國醫(yī)學科學院腫瘤醫(yī)院，保存于我院腫瘤中心實驗室。

1.2 主要試劑cDNA反轉錄試劑盒，日本TaKaRa公司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，日本TaKaRa公司；Taqman?Micro RNA 反轉錄試劑盒，美國Life Technologies公司；Taq Man?Univsersal PCR Master Mix Ⅱ，美國Life Technologies公司；SYBRPremix Ex Taq Ⅱ，日本TaKaRa公司；BCA法蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因科技有限公司；TM4SF1抗體(兔)，美國Abcam公司；β-actin抗體(鼠)，美國Sigma公司；鼠二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司；兔二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司；Western blotting試劑盒，北京普利萊北京普利萊基因科技有限公司；CCK-8試劑盒，日本Tongren公司DNA純化試劑盒，日本TaKaRa公司；質粒提取試劑盒，日本TaKaRa公司；Phusion超保真DNA聚合酶試劑盒，美國NEB公司；3TM4SF1質粒(CH891913)，美國Vigene公司。

1.3 主要儀器普通和倒置顯微鏡，日本Olympus公司；ABI7500 PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Light Cycler480 PCR儀，瑞士METTLER TOLEDO公司；DYY-Ⅲ6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,北京六一儀器廠；GDS-8000凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國UVP公司；微型垂直電泳及電轉系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；流式細胞儀，美國BD公司。

1.4 主要引物TM4SF1引物:前,5’-CAGCCCTTGGCTTAGCAGA-3’；后： 5’-CCACAATGCTTGGGTTCA-3’。GAPDH引物: 前, 5’-GAGTCAACGG ATTTGGTCGT-3’；后：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。3種siRNA序列：TM4SF1-homo-497 5’-GCGAUGCUUUCUUCUGUAUTT-3’(DsiRNA-1)；TM4SF1-homo-733 5’-GGCUCUUGGUGGAAUUGAATT-3’(DsiRNA-2)；TM4SF1-homo-813 5’-GCUCUCACCAACAGCAAUATT-3’(DsiRNA-3)。

1.5 實驗動物20只3周齡、體質量約15 g的SPF級BALB/C雌性裸鼠，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學科學院動物研究所，所用實驗器具材料均消毒滅菌后使用，進入實驗室時需穿無菌服和戴口罩。

1.6 siRNA轉染使用Lipofectamine2000在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中轉染siRNA。具體步驟：1)由上海吉瑪制藥技術有限公司設計合成的2.5 nmol雙鏈siRNA1、siRNA2和siRNA3中分別加入125 μL DEPC水，配制20 μmol·L-1的母液，置于4 ℃保存?zhèn)溆茫?)轉染相關耗材經DEPC水處理去除RNA酶，部分使用無RNA酶相關耗材；3)轉染前1 d將消化后的乳腺癌MDA-MB-231細胞接種到六孔板，過夜使細胞融合度達到50%～60%后用于轉染實驗；4)取5 μL Lipofectamine2000加入250 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中充分混勻(a液)，同時，將3種siRNA分別加入另外250 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中充分混勻，室溫靜置5 min(b液)。a液和b液溫和混勻后，室溫靜置15～20 min；5)細胞先用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗2遍，與1 mL不含血清、抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基混勻后加入培養(yǎng)皿中；6)轉染6 h后，改為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h完成轉染；7)Western blot法驗證轉染效果。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達具體步驟：細胞總蛋白的提取；BCA法測定實驗各組細胞的蛋白量；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉膜；檢測目的蛋白。

1.8 流式細胞儀分選細胞1)將處于對數生長期的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞消化、計數、離心；2)用含質量分數2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細胞，使細胞濃度達到1×106個/mL，取1 mL，加入2 μL利血平，于培養(yǎng)箱中孵育；3)30 min后，分別向加和不加利血平的每mL細胞懸液中加入Hoechst33342 2 μL，再孵育90 min；4)收集并用預冷PBS沖洗細胞2次，少量預冷PBS再次重懸細胞沉淀；5)分選細胞。

1.9 CCK-8法測定細胞生長曲線1)將處于對數生長期的轉染后pENTER、pENTER-TM4SF1、NC-siRNA DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3和同樣作為對照的乳腺癌MDA-MB-231細胞消化計數后，每孔500個細胞接種到96孔板中過夜；2)細胞生長的第1、3、5、7天，每孔加入10 μL CCK8，然后檢測450 nm處光密度(OD)值；3)繪制細胞生長曲線。

1.10 平板克隆形成實驗1)消化處于對數生長期的細胞，計數板計數細胞，每組各取500個接種于3個直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中；2)培養(yǎng)2周，可見明顯細胞集落時終止培養(yǎng)；3)棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入甲醇固定10 min后棄去甲醇，質量分數0.1%結晶紫染色20 min；4)清水沖洗培養(yǎng)皿，去除非細胞集落上的結晶紫;5)顯微鏡下記數大于50個細胞的集落數。

1.11 動物實驗1)20只3周齡、體質量約15 g的SPF級BALB/C雌性裸鼠于實驗前1 d稱重，然后按體質量分組，每組5只；2)處于對數生長期細胞經消化、離心、PBS清洗重懸，調整細胞濃度為5×106個/mL。小注射器抽吸0.1 mL接種于裸鼠雙側腋部皮下；3)5周后測量瘤體長短徑，處死裸鼠，將腫瘤完整剝離，拍照，稱重。

2 結果

2.1 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的乳腺癌干細胞和普通乳腺癌細胞中TM4SF1 mRNA和蛋白水平比較在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中，TM4SF1 mRNA在乳腺癌干細胞中的相對表達量是普通乳腺癌細胞的3倍(P<0.05)。在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中，TM4SF1蛋白在乳腺癌干細胞中表達較高，在普通乳腺癌細胞中表達較低，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，這與我們前期芯片和PCR的結果均一致。這提示TM4SF1可能在乳腺癌干細胞中發(fā)揮作用。見圖1。

圖1 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的乳腺癌干細胞和普通乳腺癌細胞中TM4SF1 mRNA(A)和蛋白(B)表達

2.2 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中TM4SF1蛋白表達比較Western blot檢測發(fā)現，與空白對照組和NC-siRNA組比較，DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組的TM4SF1蛋白表達降低，以DsiRNA-1組降低最為明顯(P均<0.05)。見圖2。

2.3 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中乳腺癌干細胞比例比較空白對照組、NC-siRNA組、DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組乳腺癌干細胞比例分別為0.96%、0.95%、0.2%、0.23%、0.25%。與空白對照組和NC-siRNA組比較，DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組的乳腺癌干細胞比例降低，以DsiRNA-1組降低最為明顯(P均<0.05)。

圖2 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系中TM4SF1蛋白表達比較

A：空白對照組；B：NC-siRNA組；C：DsiRNA-1組；D：DsiRNA-2組；E:DsiRNA-3組

2.4 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的細胞增殖速度比較各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的細胞增殖增殖速度相近(P均>0.05)。這提示TM4SF1可能是作用于乳腺癌干細胞。見圖3。

圖3 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的細胞增殖速度比較

2.5 各組三陰性乳腺癌干細胞的平板克隆形成能力比較從上述各組細胞分選出乳腺癌干細胞進行平板克隆形成實驗，其中親本MDA-MB-231細胞形成的克隆數明顯多于沉默TM4SF1表達的DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組所形成的克隆數(P均<0.05)。這提示TM4SF1能夠增強三陰性乳腺癌干細胞的克隆形成能力，即對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系的單個乳腺癌干細胞的增殖具有促進作用。見圖4。

2.6 各組裸鼠瘤體體積比較裸鼠成瘤實驗結果顯示，接種5周后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系組瘤體體積為(3.20±0.08)mm3，明顯大于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系DsiRNA-1組的(0.81±0.07)mm3，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖4 各組三陰性乳腺癌干細胞的平板克隆形成能力比較

A:空白對照組；B: NC-siRNA組; C: DsiRNA-1組; D: DsiRNA-2組; E: DsiRNA-3組

3 討論

TM4SF1基因位于人3q21-3q25，編碼一種低相對分子質量糖蛋白[5]。TM4SF1在許多上皮來源的惡性腫瘤中被發(fā)現，包括肺癌、乳腺癌、結直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌等[6-11]。有報道認為，TM4SF1參與血管內皮細胞偽足形成，進而促進血管的生成[12]。TM4SF1可能參與調控腫瘤細胞生長、活化和浸潤轉移等生物學過程[13]。研究[6]證實，抗TM4SF1單克隆抗體處理肺癌細胞后，其侵襲能力顯著降低。前列腺癌細胞的TM4SF1基因敲除后，細胞的遷移能力明顯降低[10]。TM4SF1可能還參與腫瘤細胞的上皮間質轉化這一生物學過程[14]。TM4SF1可能對多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學過程有影響，但其具體作用機制尚不明確。

間充質干細胞中TM4SF1高表達，但其他血液細胞、組織細胞和成纖維細胞中未見其表達，這提示TM4SF1可以作為干細胞表面標志物[15]。有研究[16]證實，TM4SF1可能參與腫瘤的多器官轉移再激活，但對細胞增殖無明顯影響。

本研究首先通過分析不同乳腺癌細胞中TM4SF1蛋白表達發(fā)現，其在乳腺癌干細胞中高表達。為了進一步研究TM4SF1基因在乳腺癌干細胞中的具體作用，本研究設計了針對TM4SF1基因3個不同靶點的3條siRNA干擾序列用于沉默TM4SF1基因的表達，轉染后三者均能有效沉默TM4SF1基因表達，導致乳腺癌干細胞比例降低，但細胞增殖速度無明顯差異；形成的克隆數明顯降低。體外實驗結果表明，接種5周后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系組瘤體體積明顯大于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞系DsiRNA-1組，提示乳腺癌干細胞能增強裸鼠致瘤能力，這也是關于細胞自我更新能力變化的最好證明。

綜上所述，通過靶向TM4SF1通路能夠抑制三陰性乳腺癌干細胞自我更新，該通路有可能作為乳腺癌干細胞新的治療靶點，對三陰性乳腺癌具有潛在的治療價值。但是TM4SF1影響干細胞的具體作用機制還有待進一步研究。