腎母細胞瘤1基因及其啟動子甲基化在多發性骨髓瘤患者中的表達及其與病程的關聯研究

魯崇高

(鞏義市人民醫院骨科，河南 鞏義 451200)

多發性骨髓瘤是以骨髓中漿細胞克隆性增殖為主要病理改變的漿細胞惡性腫瘤，同時漿細胞在疾病進展過程中會分泌單克隆免疫球蛋白或輕鏈[1]。多發性骨髓瘤屬于常見的血液系統惡性腫瘤，中老年人群高發,臨床上主要可見骨痛、貧血、高鈣血癥、腎損傷以及反復感染等臨床癥狀[2]。腎母細胞瘤1(WT1)基因最早在Wilms'瘤中被發現，位于11號染色體短臂，與泌尿生殖系統的生理和病理變化關聯密切；近年來有研究發現該基因參與了造血功能的相關調控，與白血病等血液系統疾病的形成有關,并且同多種造血因子存在相互作用,與造血細胞的增殖、分化以及凋亡過程關聯密切。該基因的表達以及其啟動子甲基化同血液系統疾病存在關聯，多發性骨髓瘤中可見WT1基因的表達減低，但相關表觀遺傳學研究尚不多[3]。本研究擬就WT1基因及其啟動子甲基化在多發性骨髓瘤中的表達意義以及與病程的關聯進行分析討論。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取本院就診的確診多發性骨髓瘤患者43例(觀察組)進行研究，同時選取性別、年齡具有可比性的同期健康對照者20例作為對照組。觀察組43例患者中，男性患者23例的年齡38～69(56.85±8.43)歲，女性患者20例的年齡36～69(55.34±8.99)歲。收集受試對象基本信息以及病程資料，同時對骨髓WT1的mRNA表達水平以及其基因啟動子區甲基化陽性情況進行統計分析，就WT1基因及其啟動子甲基化在多發性骨髓瘤中的表達意義及其與病程的關聯進行討論。43例多發性骨髓瘤患者中，病程≤0.5 a者18例，>0.5～<3 a者14例，≥3 a者11例。免疫球蛋白類型IgG型17例,IgA型11例,輕鏈型11例，未分泌型4例。按照Durie-Salmon分期診斷標準，Ⅰ期6例，Ⅱ期30例,Ⅲ期7例。男性、女性患者在年齡分布、分型及病情分期方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。觀察組患者納入標準：確診的多發性骨髓瘤的患者，年齡18歲及以上，病歷資料完整且知情同意，能配合本研究；排除標準：排除患有其他血液系統疾病的患者以及其他惡性腫瘤患者，排除18歲以下患者及各種原因導致不能配合本研究者。本研究已通過本院醫學倫理委員會審核。

1.2 研究方法應用聚合酶鏈反應(PCR)測定并分析WT1的mRNA表達以及基因啟動子區域CpG島的DNA甲基化水平,進而討論患者病程與WT1基因表達的相互關系。PCR使用上海生工生物工程技術服務公司提供的試劑盒，引物合成也由該公司完成，總RNA提取Trizol購自美國Invitrogen公司，提取總RNA后進行逆轉錄PCR，使用甲基化特異性PCR檢測WT1基因啟動子DNA的甲基化狀態;并對病程≤0.5、>0.5～<3、≥3 a的患者WT1 mRNA表達水平以及其啟動子區域甲基化狀態進行比較分析。

2 結果

2.1 不同患者WT1 mRNA表達水平比較及其與病程的關聯所有多發性骨髓瘤患者WT1 mRNA總體表達水平為0.55±0.08，低于對照組的0.60±0.07，差異均有統計學意義(P均< 0.05)；其中男性患者表達水平為0.54±0.08，低于對照組，差異均有統計學意義(P均< 0.05)；女性患者表達水平為0.57±0.08，與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。不同病程患者WT1 mRNA表達水平與性別無關(P>0.05)。男性、女性患者不同病程的WT1 mRNA表達水平比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；且與對照組比較差異均有統計學意義(P均< 0.05)。所有多發性骨髓瘤患者病程≤0.5 a和>0.5～<3 a的WT1 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；但均高于≥3 a患者，差異均有統計學意義(P均< 0.05)；不同病程的WT1 mRNA表達水平與對照組比較差異均有統計學意義(P均< 0.05)。見表1。

表1 不同患者WT1 mRNA表達水平比較及其與病程的關聯

2.2 不同患者WT1甲基化水平比較及其與病程的關聯男性患者WT1啟動子甲基化水平為196 814±9 700，女性為196 015±8 906，所有多發性骨髓瘤患者總體水平為196 528±9 125，均高于對照組的3 528±825，差異均有統計學意義(P均< 0.05)。男性、女性、所有多發性骨髓瘤患者不同病程的WT1啟動子甲基化水平比較差異均有統計學意義(P均<0.05)；且均高于對照組患者,差異均有統計學意義(P均<0.05)。不同病程的男性、女性、所有患者WT1啟動子甲基化水平均高于對照組，差異均有統計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 不同患者WT1啟動子甲基化水平比較其與病程的關聯

2.3 多發性骨髓瘤患者WT1 mRNA及其啟動子甲基化與病程的關聯性分析多發性骨髓瘤患者WT1 mRNA表達增高與病程延長呈負相關(r=-0.101,P<0.05)，其中男性患者WT1 mRNA表達增高與病程延長呈負相關(r=-0.090,P<0.05)，女性患者WT1 mRNA表達增高與病程延長呈負相關(r=-0.180,P>0.05)。WT1啟動子甲基化增高與病程病程延長呈正相關(r=0.150,P<0.05)；男性和女性患者中啟動子甲基化水平增高與病程延長也均呈正相關(r=0.181,P<0.05；r=0.120,P<0.05)。

3 討論

多發性骨髓瘤作為一種惡性漿細胞病，目前WHO將其歸為B細胞淋巴瘤的一種。多發性骨髓瘤的主要病理特征就是骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈，也就是M蛋白的過度生成，其中極少數患者是不產生M蛋白的未分泌型患者。統計數字提示其發病率為2～3/10萬，男性略高于女性，患者多為中老年人[4]。

國內研究[5]已經提示表觀遺傳學改變對血液系統腫瘤也起到重要作用，多發性骨髓瘤也是如此。有研究[6]提示，在多發性骨髓瘤中也可見WT1基因表達的減低，不同病程的患者之間WT1 mRNA表達情況存在差別，且分別分析男性和女性中的情況也可見差別，均以病程≥3 a患者表達水平最低，男性和女性中分別進行不同病程患者之間的兩兩比較差異均有統計學意義，合計統計時病程>0.5～<3 a患者以及病程≤0.5 a患者之間未見顯著差異。表觀遺傳學的改變在不改變原有序列的情況下影響染色質的結構或基因的正常表達,使基因發生可遺傳的功能改變[7]。一些血液系統的腫瘤中，WT1啟動子基因啟動子區域的甲基化模式會發生改變，在部分血液腫瘤細胞系中可見WT1基因表達水平的減低，在基因啟動子區域可見甲基化的增高；多發性骨髓瘤的DNA甲基化相關研究尚不多[8]，本研究中男性患者WT1啟動子甲基化水平為196 814±9 700，女性為196 015±8 906，總體水平為196 528±9 125，未見性別差異，且均高于對照組。與對照組相比，病程<3 a者WT1 mRNA表達水平較正常人表達明顯增高，而病程≥3 a患者表達水平較低，提示隨著病程延長，WT1 mRNA表達減低的情況也逐漸嚴重，但病程<3 a者WT1 mRNA表達水平較正常人表達明顯增高可能與本研究樣本量較小等情況有關，其內在原因有待今后深入研究。此外，深入分析發現，不同病程患者的WT1啟動子甲基化水平差異有統計學意義, 病程短的患者表達水平低，病程長的患者表達水平高，男性、女性患者中也均如此；且進一步兩兩比較中也均可見差異。提示患者WT1啟動子甲基化水平與病程存在關聯。本研究提示多發性骨髓瘤患者存在WT1 mRNA表達較正常人低的情況，女性中不明顯；同時病程越長，患者WT1 mRNA表達水平越低，而啟動子甲基化水平越高，啟動子甲基化水平等表觀遺傳學指標的變化體現了環境等因素的影響，其中也不乏有治療因素的作用，但與具體治療方案之間的相互關聯有待進一步研究。

綜上所述，WT1基因及其啟動子甲基化狀態在多發性骨髓瘤進展過程中發揮了一定的作用。