基于異肽鍵連接的分子粘合劑研究進展

高德英，曹佳雯, 3，孫小寶，周可鑫，張鐵濤，王謙

?

基于異肽鍵連接的分子粘合劑研究進展

高德英1，曹佳雯1, 3，孫小寶1，周可鑫1，張鐵濤2，王謙1

1 浙江萬里學院 生物與環境學院，浙江 寧波 315100 2 中國農業科學院 特產研究所，吉林 長春 130112 3 浙江大學 動物科學學院，浙江 杭州 310012

高德英, 曹佳雯, 孫小寶, 等. 基于異肽鍵連接的分子粘合劑研究進展. 生物工程學報, 2019, 35(4): 607–615.Gao DY, Cao JW, Sun XB, et al. Advances in isopeptide bond-mediated molecular superglue. Chin J Biotech, 2019, 35(4): 607–615.

異肽鍵分子粘合劑是多肽鏈中的賴氨酸 (Lys) 殘基和天冬酰胺或天冬氨酸 (Asn/Asp) 殘基側鏈自發結合形成的不可逆共價鍵，具有良好的特異性和穩定性。該反應可在極短的時間完成，且不需要特定的理化環境和催化劑。文中結合近年來國內外學者對異肽鍵分子粘合劑的研究進展，綜述了異肽鍵分子粘合劑的來源、類型、形成機制及其介導的分子環化和蛋白拓撲結構，并討論了其在合成疫苗、水凝膠和細菌納米生物反應器等領域的應用前景。

異肽鍵，分子環化，機制，SpyTag/SpyCatcher，應用

蛋白質因其高效性和特異性在工業催化、食品制造、醫藥等領域應用廣泛。然而，由于蛋白質對熱、抑制劑等耐受能力較差，導致易降解、穩定性較差，限制了其在工業加工和特定環節中的應用。因此，如何提高蛋白質的穩定性成為近年來的研究熱點。傳統提升酶穩定性的方法主要包括篩選耐熱突變體、化學修飾、添加穩定劑、改變離子濃度以及包被技術等。這些方法雖然能夠提高蛋白質的熱穩定性，但往往盲目性較大，收效甚微[1]。早前，有研究人員在細菌、植物、真菌和動物上發現一類環狀蛋白質。與常規線性蛋白質相比，環狀蛋白質具有更高的熱穩定性和結構穩定性[2-3]。

通常，蛋白質穩定性是由蛋白質分子中氨基酸主鏈及側鏈之間的相互作用和蛋白質分子與周圍溶液環境作用的綜合效應共同決定，包括疏水作用力、鹽鍵、氫鍵、范德華力以及在三級結構中形成的親水表面及內部疏水核心等。因此，蛋白質分子的穩定性與其氨基酸組成及空間構象有著重要關聯[4-5]。

異肽鍵 (Isopeptide bond) 是指蛋白質序列中氨基酸之間至少有一個非α位的氨基或羧基參與形成的酰胺鍵，廣泛存在于革蘭氏陽性菌的菌毛蛋白中。牛津大學的Mark Howarth團隊圍繞異肽鍵和蛋白質分子環化開展了系統的研究工作。他們重點分析了環化蛋白的熱穩定性及其穩定性機制，進一步優化了異肽鍵的形成條件，發現異肽鍵在極短的時間 (小于10 min) 即可形成，且不需要特定的理化環境和催化劑[6-8]。此外，他們還對利用熱變性純化環化蛋白進行了探索[9]。之后，研究人員進一步采用SpyTag/SpyCatcher系統設計了多種大分子的拓撲結構，并研究其分子穩定性機制[10]。由于異肽鍵具備良好的熱穩定性和抗逆能力，近年來，人們探索了異肽鍵的形成機制，并利用異肽鍵作為分子粘合劑在合成疫苗、細菌納米生物反應器、人工代謝通路及蛋白質水凝膠等領域的應用開展了一系列研究工作。

1 異肽鍵分子粘合劑的類型

自然界中發現的異肽鍵通常是通過谷氨酰胺轉移酶[11]、泛素連接酶[12]或轉肽酶[13]催化形成。通過Lys側鏈氨基與Asn側鏈酰胺基或Asp側鏈羧基自發結合形成的共價鍵，具有較高的特異性和穩定性[6-7]。人們最早在HK97噬菌體衣殼蛋白組裝過程中發現可以自發形成的異肽鍵[14]。2007年，Kang等[15]首次在革蘭氏陽性菌釀膿鏈球菌菌毛蛋白 (Pilin) Spy0128中發現分子內可自發形成的異肽鍵。根據物種來源和肽段性質的差異，目前常見的異肽鍵分子粘合劑主要分為isopeptag-N/pilin-N (PilinRing-N)、isopeptag/pilin-C (PilinRing-C)、SnoopTag/ SnoopCatcher (SnoopRing) 和SpyTag/SpyCatcher (SpyRing)。

PilinRing作為第一代分子粘合劑最初在革蘭氏陽性菌釀膿鏈球菌菌毛蛋白 (Pilin) Spy0128 (PDB登錄號：3B2M) 中觀察并分離得到[16]。Spy0128包含兩個異肽鍵結構域，即攜帶Asn殘基的Pilin-N和攜帶Lys殘基的N端結構域以及攜帶Lys殘基的Pilin-C和攜帶Asn殘基的C端結構域 (圖1)。之后，研究人員進一步發現來自于肺炎鏈球菌粘著物RrgA (PDB登錄號：2WW8) 的SnoopRing，在SnoopTag和SnoopCatcher肽段上分別攜帶Lys殘基和Asn殘基[17]。最近，研究人員從釀膿鏈球菌纖連蛋白CnaB2 (PDB登錄號：2X5P) 中發現第二代分子粘合劑SpyRing[7,18]。其中，SpyTag和SpyCatcher肽段分別攜帶形成異肽鍵的Asp殘基和Lys殘基。由于SpyTag/SpyCatcher形成的異肽鍵結合穩定、肽鏈較短且反應迅速，引起研究人員的廣泛關注。

圖1 異肽鍵介導的多肽連接[16]

2 異肽鍵的形成機制

從異肽鍵的形成機制來看，異肽鍵分子粘合劑的反應可以分為脫氨和脫水兩種形式。PilinRing、SnoopRing等第一代分子粘合劑的形成主要包括兩個過程：首先未質子化的Lys氨基組以N為基礎，親和攻擊Asn的Cγ，Glu作為反應催化劑協同兩個質子轉移；之后，自發形成異肽鍵并釋放氨分子[19]。第二代分子粘合劑SpyRing形成異肽鍵的機制與PilinRing相似，首先是Lys親核性攻擊Asp，隨后Glu協同質子轉移，最后形成酰胺鍵并釋放出水分子[20]。

異肽鍵分子粘合劑的自發反應十分高效。以SpyTag和SpyCatcher為例，兩個肽段分別以10 μmol/L的濃度進行混合，反應半衰期約為1 min (=1.4×103/(mol/L·s))[20]。為了探究異肽鍵在復雜環境中的形成情況，研究人員測試了環境因素 (不同pH、溫度、時間、緩沖液) 及兩個短肽的比例對異肽鍵形成的影響。結果顯示，異肽鍵的形成不需要特殊的理化環境，SpyTag和SpyCatcher兩個肽段在25 ℃、pH 7.0的條件下反應15 min的結合率達到80%以上[7]，且增加SpyTag肽段的摩爾濃度有助于反應的徹底進行[8]。

為了驗證Lys、Asn/Asp和Glu是形成異肽鍵的關鍵殘基，Howarth團隊對這幾個氨基酸依次進行點突變 (KA/NA/DA/EQ)，發現當其中的任意一個氨基酸發生突變，均不能形成異肽鍵[7,9,21-22]。該突變結果從側面驗證了Lys、Asn/Asp和Glu是異肽鍵形成機制中的關鍵氨基酸。

此外，若將幾種不同的肽段混合，它們相互之間是否會產生交叉反應呢？研究表明，SpyRing與SnoopRing相互之間并無交叉反應[8]。雖然SnoopTag含有Lys殘基，SpyTag帶有Asp殘基，但兩個肽段并不包含發揮質子轉移作用的Glu殘基，因此無法形成異肽鍵。近期，本課題組通過實驗測試了isopeptag-N/pilin-N (PilinRing) 和Spying及isopeptag-N/pilin-N (PilinRing) 和SnoopRing之間同樣沒有發生交叉反應。關于isopeptag/pilin-C (PilinRing) 與其他肽段是否產生交叉反應仍有待驗證。

3 異肽鍵介導的分子環化

環肽(Cyclic peptide) 是一類天然存在的具有環狀結構的多肽分子[1-2]。由于環化結構具有良好的分子穩定性，人們采用基因工程、蛋白質工程等方法研發出多種分子環化技術，如蛋白質反式剪接 (Protein trans-splicing，PTS)[23-24]、內含肽介導的蛋白表達連接 (Expressed protein ligation，EPL)[25]、轉肽酶 (Sortase) 介導的轉肽作用 (Sortagging)[26-27]等。雖然這些環化方式可以提高蛋白的穩定性，但實現上述連接方式通常需要復雜的反應條件或特定催化劑的參與，且反應效率較低，甚至存在剪接的不可控性、缺乏通用性、產物復雜、得率較低等問題[28-29]。

超強分子粘合劑由于其特異性、穩定性且反應快速的優勢，為蛋白質環化開辟了新思路。近年來，利用異肽鍵介導的分子粘合劑對蛋白質進行分子修飾，取得了較大進展 (表1) 。2015年，Schoene等[9]將SnoopTag/SnoopCatcher和isopeptag/pilin-C系統應用于β-內酰胺酶的分子環化，發現野生酶在55 ℃條件下發生聚沉、可溶性蛋白顯著減少，導致活性快速喪失，而環化蛋白活性則幾乎不受影響。差示掃描量熱法 (Differential scanning calorimetry) 分析線性和環化蛋白的溶解溫度，與線性蛋白相比，環化蛋白的m值顯著上升。野生植酸酶在55 ℃以上的環境中加熱10 min可溶性蛋白活性開始降低，而SpyTag/SpyCatcher環化的植酸酶在90 ℃才開始略微下降，且活性影響較小。圓二色譜 (Circular dichroism) 檢測結果顯示，與野生型植酸酶相比，環化后的植酸酶二級結構穩定性顯著增加。Wang等[30]將SpyTag/ SpyCatcher用于介導地衣聚糖酶的環化，經熱處理后，環化蛋白的活性顯著高于線性蛋白。此外，有研究發現SpyTag/SpyCatcher環化增強了螢火蟲熒光素酶的熱穩定性，同時其生物活性不受影響[32]。以上各研究團隊的結果可以得出同樣的結論，即環化后蛋白的熱穩定性、抗逆能力顯著提高。

基于環化蛋白的耐熱性，環化方式可以用于鑒定目標蛋白的存在及純化目標蛋白。與一般蛋白純化方式相比，該方法雖然會損失部分酶活性，但操作簡便快速，檢測及純化效果依然可觀[9]。本實驗室長期致力于工業酶的分子改良，已成功構建了多種不同構象的酶分子，并對環化蛋白的熱穩定性及結構穩定性進行研究，為后續研發多功能復合酶打下了良好的基礎。然而，利用異肽鍵連接的分子粘合劑并非“無痕” (Not traceless)[7]，對蛋白質進行分子環化時需要在其末端加上SpyTag/SpyCatcher肽段。雖然實際操作時通常在各功能結構域之間加入連接肽來減少空間構象造成的相互干擾，但目前關于SpyTag/SpyCatcher肽段的插入是否會影響蛋白催化性質并沒有一致的結論。有研究表明，環化前后熒光素酶和β-內酰胺酶的m值沒有顯著變化[9,32]，而環化前后的木聚糖酶和地衣聚糖酶的動力學參數則表現出顯著性差異[30,36]。此外，異肽鍵并未達到接近擴散極限 (Diffusion limit) 的反應速率 (如生物素-鏈霉親和素)[43]。SpyTag/SpyCatcher僅在微摩爾級和更高濃度肽段間發生反應，從而限制了其應用范圍。

表1 基于異肽鍵連接的分子粘合劑的應用

4 基于異肽鍵分子粘合劑的拓撲結構

21世紀以來，生物技術和高分子化學均取得了很大發展。然而，要實現對高分子的序列、尺寸、組裝過程和拓撲結構的全面精確控制仍是人們面臨的一大挑戰。近期，利用可基因編碼的SpyTag/SpyCatcher合成類彈性蛋白 (Elastin-like proteins，ELPs)，為蛋白質拓撲結構的開發提供了新思路。

北京大學的張文彬研究員將SpyTag和SpyCatcher基因插入類彈性蛋白基因中，以便在原位進行轉錄后的拓撲修飾。利用帶有SpyTag和SpyCatcher不同標簽的彈性蛋白在體外組合，獲得蝌蚪型、三臂星型和H型等多種蛋白拓撲結構[10]。研究人員同時探討了不同表達速度對環化蛋白大小的影響，表達速度較慢時只形成單環，而快速表達時，既有單環也有多環的形成，這一結果為構建目標環化蛋白提供了依據。隨后張文彬團隊將SpyTag/SpyCatcher用于蛋白質索烴的細胞合成，其研究結果表明，較之線性突變及循環單體蛋白，蛋白質索烴結構具有更好的穩定性[34]。最近，該團隊進一步開發出高效的、基因編碼的、機械聯鎖的SpyX模塊 (AXB和BXA)，用于體內工程蛋白質的拓撲結構[33]。包含SpyX模塊的融合蛋白的表達導致了多種機械聯鎖蛋白拓撲的形成，包括蛋白質鏈狀結構、專性二聚體和恒星蛋白。在蛋白質工程中使用SpyX模塊有很多優勢：形成的專性二聚體在較低濃度下也不會電離；可以簡單地通過直接表達來形成星型蛋白質；可以提高蛋白質的穩定性，如增強抗胰蛋白酶酶解的能力。SpyX模塊擴大了蛋白質拓撲結構的范圍，成為進一步設計蛋白質功能特性的通用平臺。該團隊基于SpyTag/ SpyCatcher和固有無序蛋白 (Intrinsically disordered proteins，IDPs) 高電荷密度的屬性，進一步改造天然SpyCatcher短肽，使其帶有大量電荷，發現帶有大量電荷的SpyCatcher (-) 短肽仍然可以與SpyTag形成異肽鍵[44]。此外，SpyCatcher (-) 短肽還能絡合相反電荷的聚合物，實現展開和折疊態雙態的轉變等功能，大大擴寬了生物材料體內外的合成。

5 異肽鍵分子粘合劑的應用

5.1 合成疫苗

合成疫苗是疫苗開發歷史上的一個里程碑，與傳統減毒或滅活疫苗相比，合成疫苗更加安全。第一代合成疫苗主要是基于DNA重組技術和基因操縱，不僅耗費大量時間，而且成本高昂[37]。

病毒樣顆粒 (Virus-like particle，VLPs) 是非傳染性的自組裝納米粒子，在醫學和納米技術中發揮重要作用，特別是在疫苗接種方面。然而，通過基因融合或化學修飾，對目標抗原進行修飾，往往會導致衣殼的錯誤組裝或抗原錯誤折疊，從而阻礙保護性免疫的產生。近年來，Howarth團隊將分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher用于疫苗接種，通過將SpyCatcher融合了噬菌體蛋白AP205 (AP205 CP3)、SpyTag與瘧疾抗原 (CIDR和Pfs25) 混合后與SpyCatcher-AP205共價耦合，可以顯著提高抗原免疫原性[21]。Singh等[45]利用SpyTag- Pfs48/45與SpyCatcher-AP205共價結合，同樣使抗原免疫原性得到提高。該團隊進一步驗證了表皮生長因子受體和端粒酶中與癌癥相關的肽鏈的耦合。注射用瘧疾抗原修飾的SpyCatcher-VLPs，在一次免疫后就能有效地誘導抗體反應[21]。此外，通過多聚體支架或類病毒顆粒增強細胞信號也可以增強免疫反應不佳的抗原的免疫應答[27]。SpyTag/SpyCatcher蛋白質組裝技術產生的新疫苗在發揮個體功能的同時，還可以有效地誘導T細胞和B細胞反應。這種蛋白質組裝策略可能對高通量抗原篩選或疫苗的快速產生具有重要理論與實踐意義[37,46]。另有研究人員將SpyTag/SpyCatcher用于設計抗體標記，成功實現在亞納米級范圍內展示細胞毒性位點的抗體藥物復合體，從而擴展了特定抗體的結合位點[47]。

5.2 細菌納米生物反應器

迄今為止，研究涉及的所有革蘭氏陽性或陰性細菌，都是從其表面產生外膜囊泡 (Outer membrane vesicles，OMVs)[48]，致病細菌菌株毒性因子通過外膜囊泡感染宿主細胞。基于這種感染途徑，研究人員結合分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher系統開發了一種使細菌能夠同時生產、包裝和分泌活性酶的新方法。OmpA是一種高度表達的細菌重組蛋白，與細菌膜上小分子的運輸有關[49]。來自缺陷短波單胞菌的磷酸三酯酶 (Phosphotriesterase，PTE) 含有Zn/Zn活性位點，能通過水解反應將芳基磷酸酯轉化為無毒的二基磷酸和芳醇，從而分解有機磷酸酯。然而，磷酸三酯酶存在水解效率低、易失活等缺陷，制約了其在有機磷降解中的應用。針對這一問題，研究人員設計了OmpA-SpyTag和SpyCatcher-PTE兩種構象蛋白，通過異肽鍵實現共價結合。這種共價表達的途徑不僅提高了PTE的生產水平，也提高了其穩定性，為有機磷污染區域的環境修復提供了一個很好的模型[44]。這項研究的結果還可應用于設計類似的蛋白質包裝策略，用于不同的藥物輸送、醫學診斷等。Giessen等[40]將SpyTag/SpyCatcher用于構建MS2噬菌體衣殼的體內封裝系統，為生成高度穩定的多酶納米反應器提供了一種簡單而有效的方法。

研究人員將SpyTag/SpyCatcher系統用于工程催化生物膜，利用大腸桿菌的纖維系統來創建一個功能性的納米纖維網絡，進行酶的共價固定。將一個α-淀粉酶與SpyCatcher進行重組，并將其固定在大腸桿菌的纖維上與SpyTag進行共價結合。這種酶化的改良生物膜可以在廣泛的pH值和有機溶劑條件下維持其活性。此外，與其他依賴于高細胞代謝的基于生物膜的催化劑相比，改良后的生物膜在細胞死亡后仍然保持活躍狀態。這一研究將在綠色生物催化領域發揮廣泛作用，如藥物合成、廢水中的藥物分解、地下水中污染物的去除和生物能源的生產等[37]。

5.3 水凝膠

由于蛋白質水凝膠的生物友好性、潛在的生物醫學應用以及精確控制蛋白質結構和功能的能力，以蛋白質為基礎的水凝膠已經引起了研究人員的極大關注。由合成聚合物或天然生物分子組成的傳統的水凝膠，機械性質較弱，制約其在不同領域的廣泛應用。近年來，基于分子粘合劑SpyTag/ SpyCatcher良好的特異性和穩定性，研究人員將其用于蛋白質水凝膠的研究。Gao等[38]設計了SpyTag/SpyCatcher介導的串聯模塊化蛋白質水凝膠。結果表明，帶有SpyTag/SpyCatcher模塊化的蛋白質可以迅速相互反應，從而形成柔軟的、化學交聯的蛋白質水凝膠。該團隊成功地使用這些水凝膠來封裝和培養3D的人類肺纖維細胞并將其作為藥物輸送的容器。Wang等[39]利用SpyTag/ SpyCatcher研發出腺苷鈷胺素 (B12) 依賴的光反應蛋白水凝膠，并將其應用于控制干細胞蛋白質的釋放，將刺激反應的蛋白質直接組裝到水凝膠中，提供了一種設計可動態調節材料的通用策略。

5.4 人工代謝通路

隨著生物工程及酶工程的迅速發展，酶在工業生產中的應用越來越廣泛。工業酶普及的同時，酶穩定性和催化活性低的問題不容忽視。針對這一問題，研究人員利用分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher來設計人工代謝通路，提高工業酶的應用價值。蛋白質支架可以實現多酶復合體的超分子結構，但是蛋白質支架需要特定的結合域，存在不同結合域的交叉反應及不同物種親和力不高的問題[50]，SpyTag/ SpyCatcher的特異性結合及異肽鍵的穩定性可以改善蛋白質支架的親和力和穩定性。此外，在還原條件下共價二硫鍵很容易分離，是可逆反應[16]。而分子粘合劑SpyTag/SpyCatcher是基因編碼的不可逆的共價結合，更有利于構建穩定的多酶復合體。

6 結語

隨著生物技術的快速發展，有關分子粘合劑的研究成果豐碩。近年來，研究人員相繼發現了PilinRing、SnoopRing及SpyRing幾種類型的分子粘合劑，并針對異肽鍵的形成機理開展了深入研究，為后續分子粘合劑的應用提供了理論依據。絕大多數蛋白質的穩定性較差，制約了其在工業催化、食品制造、醫藥領域的應用。長期以來，如何有效提升蛋白質的穩定性一直是科研工作者關注的焦點。基于異肽鍵連接的分子粘合劑具備良好的穩定性及特異性，使其在多個領域具有廣闊的應用前景。此外，可基因編碼、修飾的SpyTag/ SpyCatcher系統，為人工多價疫苗、納米生物反應器、蛋白質拓撲結構的開發等提供了新思路。

[1] Aboye TL, Camarero JA. Biological synthesis of circular polypeptides. J Biol Chem, 2012, 287(32): 27026–27032.

[2] Cascales L, Craik DJ. Naturally occurring circular proteins: distribution, biosynthesis and evolution. Org Biomol Chem, 2010, 8(22): 5035–5047.

[3] Jagadish K, Borra R, Lacey V, et al. Expression of fluorescent cyclotides using protein trans-splicing for easy monitoring of cyclotide-protein interactions. Angew Chem Int Ed, 2013, 52(11): 3126?3131.

[4] Turner P, Mamo G, Karlsson EN. Potential and utilization of thermophiles and thermostable enzymes in biorefining. Microb Cell Fact, 2007, 6: 9.

[5] Volkmann G, Murphy PW, Rowland EE, et al. Intein-mediated cyclization of bacterial acyl carrier protein stabilizes its folded conformation but does not abolish function. J Biol Chem, 2010, 285(12): 8605?8614.

[6] Zakeri B, Howarth M. Spontaneous intermolecular amide bond formation between side chains for irreversible peptide targeting. J Am Chem Soc, 2010, 132(13): 4526?4527.

[7] Zakeri B, Fierer JO, Celik E, et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(12): E690?E697.

[8] Veggiani G, Nakamura T, Brenner MD, et al. Programmable polyproteams built using twin peptide superglues. Proc Natl Acad Sci USA, 2016, 113(5): 1202?1207.

[9] Schoene C, Bennett SP, Howarth M. SpyRing interrogation: analyzing how enzyme resilience can be achieved with phytase and distinct cyclization chemistries. Sci Rep, 2016, 6: 21151.

[10] Zhang WB, Sun F, Tirrel DA, et al. Controlling macromolecular topology with genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry. J Am Chem Soc, 2013, 135(37): 13988?13997.

[11] Bakker ENTP, Pistea A, VanBavel E. Transglutaminases in vascular biology: relevance for vascular remodeling and atherosclerosis. J Vasc Res, 2008, 45(4): 271–278.

[12] Komander D, Rape M. The ubiquitin code. Annu Rev Biochem, 2012, 81: 203–229.

[13] Shah NH, Muir TW. Inteins: nature’s gift to protein chemists. Chem Sci, 2014, 5(2): 446?461.

[14] Dhillon EKS, Dhillon TS, Lai ANC, et al. Host range, immunity and antigenic properties of lambdoid coliphage Hk97. J Gen Virol, 1980, 50(1): 217?220.

[15] Kang HJ, Coulibaly F, Clow F, et al. Stabilizing isopeptide bonds revealed in gram-positive bacterial pilus structure. Science, 2007, 318(5856): 1625?1628.

[16] Veggiani G, Zakeri B, Howarth M. Superglue from bacteria: unbreakable bridges for protein nanotechnology. Trends Biotechnol, 2014, 32(10): 506?512.

[17] Izoré T, Contreras-Martel C, El Mortaji L, et al. Structural basis of host cell recognition by the pilus adhesin from. Structure, 2010, 18(1): 106?115.

[18] Amelung S, Nerlich A, Rohde M, et al. The FbaB-type fibronectin-binding protein ofpromotes specific invasion into endothelial cells. Cell Microbiol, 2011, 13(8): 1200?1211.

[19] Hu XQ, Hu H, Melvin JA, et al. Autocatalytic intramolecular isopeptide bond formation in gram-positive bacterial pili: a QM/MM simulation. J Am Chem Soc, 2011, 133(3): 478–485.

[20] Reddington SC, Howarth M. Secrets of a covalent interaction for biomaterials and biotechnology: SpyTag and SpyCatcher. Curr Opin Chem Biol, 2015, 29: 94–99.

[21] Brune KD, Leneghan DB, Brian IJ, et al. Plug-and-display: decoration of virus-like particles via isopeptide bonds for modular immunization. Sci Rep, 2016, 6: 19234.

[22] Fierer JO, Veggiani G, Howarth M. SpyLigase peptide-peptide ligation polymerizes affibodies to enhance magnetic cancer cell capture. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(13): E1176–E1181.

[23] Mujika JI, Lopez X, Mulholland AJ. Mechanism of C-terminal intein cleavage in protein splicing from QM/MM molecular dynamics simulations. Org Biomol Chem, 2012, 10(6): 1207–1218.

[24] B?cker JK, Friedel K, Matern JCJ, et al. Generation of a genetically encoded, photoactivatable intein for the controlled production of cyclic peptides. Angew Chem Int Ed, 2015, 127(7): 2144–2148.

[25] de Rosa L, Cortajarena AL, Romanelli A, et al. Site-specific protein double labeling by expressed protein ligation: applications to repeat proteins. Org Biomol Chem, 2012, 10(2): 273–280.

[26] Jia XY, Kwon S, Wang CIA, et al. Semienzymatic cyclization of disulfide-rich peptides using sortase A. J Biol Chem, 2014, 289(10): 6627–6638.

[27] Wu ZM, Guo XQ, Gao J, et al. Sortase A-mediated chemoenzymatic synthesis of complex glycosylphosphatidylinositol-Anchored protein. Chem Commun, 2013, 49(99): 11689–11691.

[28] Minato Y, Ueda T, Machiyama A, et al. Segmental isotopic labeling of a 140 kDa dimeric multi-domain protein CheA fromby expressed protein ligation and protein-splicing. J Biomol NMR, 2012, 53(3): 191–207.

[29] Cui CX, Zhao WT, Chen JL, et al. Elimination ofcleavage between target protein and intein in the intein-mediated protein purification systems. Protein Expr Purif, 2006, 50(1): 74–81.

[30] Wang JD, Wang YL, Wang XZ, et al. Enhanced thermal stability of lichenase from168 by SpyTag/SpyCatcher-mediated spontaneous cyclization. Biotechnol Biofuels, 2016, 9: 79.

[31] Gilbert C, Howarth M, Harwood CR, et al. Extracellular self-assembly of functional and tunable protein conjugates from. ACS Synth Biol, 2017, 6(6): 957–967.

[32] Si M, Xu Q, Jiang L, et al. SpyTag/SpyCatcher cyclization enhances the thermostability of firefly luciferase. PLoS ONE, 2016, 11(9): e0162318.

[33] Liu D, Wu WH, Liu YJ, et al. Topology engineering of proteinsusing genetically encoded, mechanically interlocking SpyX modules for enhanced stability. ACS Cent Sci, 2017, 3(5): 473–481.

[34] Wang XW, Zhang WB. Cellular synthesis of protein catenanes. Angew Chem, 2016, 55(10): 3442–3446.

[35] Wang HH, Altun B, Nwe K, et al. Proximity-based sortase-mediated ligation. Angew Chem, 2017, 56(19): 5349–5352.

[36] Lin YQ, Jin WH, Wang JD, et al. A novel method for simultaneous purification and immobilization of a xylanase-lichenase chimera via SpyTag/SpyCatcher spontaneous reaction. Enzyme Microb Technol, 2018, 115: 29–36.

[37] Liu ZD, Zhou H, Wang WJ, et al. A novel method for synthetic vaccine construction based on protein assembly. Sci Rep, 2014, 4: 7266.

[38] Gao XY, Fang J, Xue B, et al. Engineering protein hydrogels using SpyCatcher-SpyTag chemistry. Biomacromolecules, 2016, 17(9): 2812–2819.

[39] Wang R, Yang ZG, Luo JR, et al. B12-dependent photoresponsive protein hydrogels for controlled stem cell/protein release. Proc Natl Acad Sci USA, 2017, 114(23): 5912–5917.

[40] Giessen TW, Silver PA. A catalytic nanoreactor based onencapsulation of multiple enzymes in an engineered protein nanocompartment. ChemBioChem, 2016, 17(20): 1931–1935.

[41] Alves NJ, Turner KB, Daniele MA, et al. Bacterial nanobioreactors-directing enzyme packaging into bacterial outer membrane vesicles. ACS Appl Mater Interfaces, 2015, 7(44): 24963–24972.

[42] Botyanszki Z, Tay PKR, Nguyen PQ, et al. Engineered catalytic biofilms: site-specific enzyme immobilization onto.curli nanofibers. Biotechnol Bioeng, 2015, 112(10): 2016–2024.

[43] Hyre DE, Le Trong I, Merritt EA, et al. Cooperative hydrogen bond interactions in the streptavidin-biotin system. Protein Sci, 2006, 15(3): 459–467.

[44] Cao Y, Liu D, Zhang WB. Supercharging SpyCatcher toward an intrinsically disordered protein with stimuli-responsive chemical reactivity. Chem Commun, 2017, 53(63): 8830–8833.

[45] Singh SK, Thrane S, Janitzek CM, et al. Improving the malaria transmission-blocking activity of a48/45 based vaccine antigen by SpyTag/SpyCatcher mediated virus-like display. Vaccine, 2017, 35(30): 3726–3732.

[46] Leneghan DB, Miura K, Taylor IJ, et al. Nanoassembly routes stimulate conflicting antibody quantity and quality for transmission-blocking malaria vaccines. Sci Rep, 2017, 7: 3811.

[47] Siegmund V, Piater B, Zakeri B, et al. Spontaneous isopeptide bond formation as a powerful tool for engineering site-specific antibody-drug conjugates. Sci Rep, 2016, 6: 39291.

[48] Avila-Calderon ED, Araiza-Villanueva MG, Cancino-Diaz JC, et al. Roles of bacterial membrane vesicles. Arch Microbiol, 2015, 197(1): 1–10.

[49] Wang Y. The function of OmpA in. Biochem Biophys Res Commun, 2002, 292(2): 396–401.

[50] Pr?schel M, Detsch R, Boccaccini AR, et al. Engineering of metabolic pathways by artificial enzyme channels. Front Bioeng Biotechnol, 2015, 3: 168.

Advances in isopeptide bond-mediated molecular superglue

Deying Gao1, Jiawen Cao1, 3, Xiaobao Sun1, Kexin Zhou1, Tietao Zhang2, and Qian Wang1

1 College of Biological & Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, Zhejiang, China 2 Institute of Special Wild Economic Animals and Plants, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130112, Jilin, China 3 College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310012, Zhejiang, China

Isopeptide bond-mediated molecular superglue is the irreversible covalent bond spontaneously formed by the side chains of lysine (Lys) and asparagine/aspartic acid (Asn/Asp) residues. The peptide-peptide interaction is specific, stable, and can be achieved quickly without any particular physicochemical factor. In the light of recent progress by domestic and foreign researchers, here we summarize the origin, assembly system and mechanism of isopeptide bond reaction, as well as the molecular cyclization and protein topological structure mediated by it. The prospect for its application in synthetic vaccine, hydrogel and bacterial nanobiological reactor is further discussed.

isopeptide bond, molecular cyclization, mechanism, SpyTag/SpyCatcher, application

10.13345/j.cjb.180303

July 20, 2018;

September 14, 2018

National Undergraduate Innovation and Entrepreneurship Training Program (No. 201710876020), Zhejiang Provincial Top Key Discipline of Bioengineering (No. KF2016010).

Qian Wang. Tel: +86-574-88222391; E-mail: wangq@zwu.edu.cn

國家級大學生創新創業訓練計劃 (No. 201710876020)，浙江省生物工程重中之重學科開放基金 (No. KF2016010) 資助。

(本文責編 陳宏宇)