探究TRPV1激活對(duì)離體壁細(xì)胞胃酸分泌的影響

劉宇涵

摘 要 目的：探究TRPV1激活及激活程度對(duì)離體胃壁細(xì)胞胃酸分泌的影響。方法：取大鼠離體胃壁細(xì)胞，借助辣椒素（capsaicin，CAP）及釕紅作用于TRPV1，測(cè)量H+-K+-ATP酶活性判斷胃酸分泌情況。結(jié)果：不同濃度CAP對(duì)胃酸分泌作用不定，釕紅同理。結(jié)論：對(duì)于離體壁細(xì)胞，TRPV1激活對(duì)于其胃酸分泌作用不固定。

關(guān)鍵詞 大鼠 TRPV1 離體胃壁細(xì)胞 胃酸分泌 CAP 釕紅 H+-K+-ATP酶

中圖分類號(hào)：R57 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.16400/j.cnki.kjdkz.2019.02.027

Investigate the Effect of TRPV1 Activation on Gastric

Acid Secretion in Isolated Parietal Cells

LIU Yuhan

（Zhejiang University， Hangzhou， Zhejiang 310029）

Abstract Objective： To investigate the effects of TRPV1 activation and activation on gastric acid secretion of gastric parietal cells in vitro. Methods： Rat gastric parietal cells were isolated and treated with capsaicin （CAP） and ruthenium red on TRPV1. The activity of H +-K +-ATP enzyme was measured to determine gastric acid secretion. Results： The effects of different concentrations of CAP on gastric acid secretion were uncertain， and ruthenium red was the same. Conclusion： For isolated parietal cells， the effect of TRPV1 activation on gastric acid secretion is not fixed.

Keywords rat； TRPV1； isolated gastric parietal cells； gastric acid secretion； CAP； ruthenium red； H +-K +-ATP enzyme

TRPV1是瞬態(tài)電壓感受器陽(yáng)離子通道，可被CAP所激發(fā)。釕紅作為電壓敏感的鈣離子通道抑制劑，可拮抗CAP的激動(dòng)作用。TRPV1廣泛分布于神經(jīng)纖維支配的系統(tǒng)和組織，在壁細(xì)胞中也有分布，可調(diào)節(jié)胃酸分泌。為排除神經(jīng)系統(tǒng)干擾，本實(shí)驗(yàn)對(duì)象為離體胃壁細(xì)胞。根據(jù)測(cè)得的吸光度值計(jì)算H+-K+-ATP酶活性，從而判斷胃酸分泌功能。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

雄性健康SD大鼠13只，6周齡左右，體重180？0g。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分離培養(yǎng)、鑒定并保存壁細(xì)胞

（1）配置壁細(xì)胞分離及培養(yǎng)所需液體 消化液用Mdeium A配制，鏈霉蛋白酶濃度為1 g/L。基礎(chǔ)培養(yǎng)液：Ham S F-12/DMEM （ 1=1 Gibco） ，按要求加入Na2CO3 ，調(diào)pH在7.1～7.3，過(guò)濾除菌，分裝備用。

（2）大鼠胃粘膜壁細(xì)胞的分離及原代培養(yǎng) 取非禁食SD大鼠，處死取胃，放入冰冷Hanks液中，在胃底作小切口，將胃翻轉(zhuǎn)，用Hanks液洗去食物殘?jiān)脱E，結(jié)扎。之后用注射器將消化酶注入胃袋，注滿為止。將翻轉(zhuǎn)后的胃囊先后放入Medium A、B中消化并收集細(xì)胞。

2.2 原代培養(yǎng)的大鼠胃壁細(xì)胞的鑒定

將細(xì)胞制成懸液，加入終濃度100 mol/L的吖啶橙孵育5 min，置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核發(fā)黃綠色熒光，胞質(zhì)發(fā)紅色熒光，即可確定為壁細(xì)胞。

2.3 預(yù)實(shí)驗(yàn)：確定激活TRPV1受體的CAP濃度

在培養(yǎng)有胃壁細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，將CAP終濃度分別調(diào)整為：0、1 mol/L、10、0.1、1、10mmol/L。測(cè)定H+-K+-ATP酶活性。

2.4 測(cè)定壁細(xì)胞H+-K+-ATP酶活性

將所得壁細(xì)胞等量隨機(jī)分為四組A、B、C、D（依次對(duì)應(yīng)激動(dòng)劑+拮抗劑組、激動(dòng)劑組、拮抗劑組、空白對(duì)照組），分別加入試劑。分光光度計(jì)660 nm處檢測(cè)各樣本對(duì)照管、測(cè)定管及標(biāo)準(zhǔn)管OD值。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

將分別重復(fù)了5次的4組實(shí)驗(yàn)數(shù)值用方差分析處理。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 CAP組與CAP加釕紅組的壁細(xì)胞酶活性隨CAP濃度變化

其中空白處為去除負(fù)值（去除理由見實(shí)驗(yàn)討論）、其余數(shù)據(jù)經(jīng)Q檢驗(yàn)無(wú)離群值均保留（表1）。

3.2 上述結(jié)果總結(jié)

在編號(hào)1、4、5中：兩組酶活力無(wú)顯著性差異，表明釕紅對(duì)CAP無(wú)顯著影響。在6實(shí)驗(yàn)中：阻斷組酶活力顯著大于非阻斷組，表明釕紅對(duì)CAP的激活呈增益作用。在2、3實(shí)驗(yàn)中：非阻斷組酶活力遠(yuǎn)大于阻斷組，表明釕紅對(duì)CAP的激活呈抑制作用。CAP濃度為100umol/L時(shí)，六次實(shí)驗(yàn)的CAP組中有三次酶活力高于15，故CAP最適濃度應(yīng)位于100umol/L左右。在一定范圍內(nèi)，CAP濃度增加，酶活性升高，增加到一定程度呈下降趨勢(shì)，當(dāng)CAP濃度非常高時(shí)，酶活性又顯著升高。

4 實(shí)驗(yàn)討論

（1）TRPV1的特點(diǎn)與功能：TRPV1是一類具有 6個(gè)跨膜區(qū)的膜蛋白，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的感覺(jué)神經(jīng)纖維。[1]研究發(fā)現(xiàn)TRPV1具有以下生物學(xué)特性：a.TRPV1被激活時(shí)，能引起Ca2+、Mg2 +等陽(yáng)離子內(nèi)流；b.可以被多種理化因素激活；c.可以被多種炎癥介質(zhì)激活；d.參與體內(nèi)多種生理和病理過(guò)程。[2]其中，TRPV1 在支配胃腸道的感覺(jué)神經(jīng)元及纖維內(nèi)廣泛表達(dá)，可參與黏膜保護(hù)、胃腸道運(yùn)動(dòng)等。

（2）釕紅對(duì)于CAP的作用不定：釕紅是一種陽(yáng)離子染料，為TRPV1受體的競(jìng)爭(zhēng)拮抗劑。推測(cè)其有兩個(gè)與釕紅結(jié)合的位點(diǎn)，一個(gè)為可逆性位點(diǎn)，可逆地阻斷CAP誘發(fā)的反應(yīng)。另一個(gè)為不可逆性結(jié)合位點(diǎn)，它參與TRPV1的脫敏作用。[3]另外，釕紅可能在抑制TRPV1的同時(shí)，對(duì)于細(xì)胞其他位點(diǎn)也有作用，其作用性質(zhì)尚不清楚。釕紅試劑本身的質(zhì)量也有待考究。

（3）CAP對(duì)于胃酸分泌作用不定：根據(jù)以往實(shí)驗(yàn)研究表明，CAP對(duì)于胃酸分泌的影響與其給藥濃度、途徑、時(shí)間均有關(guān)。[4]低劑量范圍內(nèi)CAP，胃酸分泌的抑制作用隨CAP劑量增多而增強(qiáng)。在高劑量或去除神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控因素下，胃酸分泌呈促進(jìn)作用；本實(shí)驗(yàn)中，辣椒素與細(xì)胞作用時(shí)間、途徑各組基本保持一致，因而基本無(wú)干擾；CAP作用于離體胃壁細(xì)胞，相關(guān)的神經(jīng)因素影響較低，但不能確保CAP作用于細(xì)胞相同位點(diǎn)，以及辣椒素的濃度對(duì)于胃酸分泌也存在影響。

（4）CAP對(duì)于胃酸分泌的可能作用機(jī)制：CAP對(duì)于胃酸分泌的調(diào)節(jié)在離體細(xì)胞情況下，主要是通過(guò)作用于細(xì)胞的TRPV1受體，其過(guò)程可能與相關(guān)離子內(nèi)流，激活細(xì)胞功能有關(guān)，或引起神經(jīng)元及其纖維釋放神經(jīng)遞質(zhì)、肽類物質(zhì)從而調(diào)節(jié)胃酸分泌。[5]

（5）實(shí)驗(yàn)存在的不足：取胃過(guò)程中，胃受到損傷，或消化液漏出，導(dǎo)致消化不徹底，獲得細(xì)胞量較少。壁細(xì)胞熒光顯微鏡下的觀察與鑒定存在問(wèn)題，濃度可能尚未70%以上，導(dǎo)致成纖維細(xì)胞、主細(xì)胞等其他細(xì)胞對(duì)酶活性產(chǎn)生干擾。實(shí)驗(yàn)材料中，釕紅作用缺乏顯著性的原因可能是保存時(shí)未能保持良好避光，降低了釕紅的生物活性。實(shí)驗(yàn)流程中，測(cè)量組先將樣本液加入試劑盒中再水浴，對(duì)照組相反。由于該反應(yīng)需在37℃條件下完成，且37℃水浴環(huán)境不會(huì)使氫鉀ATP酶失活，故理論上，測(cè)量組的酶活性應(yīng)強(qiáng)于對(duì)照組。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之不符，分析為磷污染或?qū)嶒?yàn)操作不當(dāng)，故舍去。產(chǎn)生原因：可能出現(xiàn)磷污染，造成對(duì)照管的比色值較高；向測(cè)量管和對(duì)照管加入細(xì)胞樣品時(shí)未充分混勻細(xì)胞液，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目不等。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

對(duì)于離體壁細(xì)胞，TRPV1激活對(duì)于其胃酸分泌作用不固定。

參考文獻(xiàn)

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