光照對腐殖酸生物可利用性的增效作用的研究

任 東

(西華師范大學環境科學與工程學院，四川 南充 637009)

1 引 言

腐殖酸(HA)是一類組成和結構復雜、物理上不均勻的有機混合物，主要來源于動植物殘體的生物化學分解過程，廣泛分布于沉積物、沼澤、湖泊、河流及海洋等水生生態系統[1]。以碳含量計，HA在自然水體中的含量常為0.5～100 mgC/L[2-3]，可占水體總溶解性有機質的40%～80%[4]。在水生生態系統中，HA本身是一種生物難利用的混合物，但其結構組成易被光化學、氧化還原、絡合和溶解-沉淀等作用所改變。HA對波長小于600nm的太陽光具有強烈的吸收，其光化學過程通常會對水體中各物理、化學和生物過程產生重要的影響[5]，如加速碳、氮等元素的生物地球化學循環，為異養型微生物提供生長所需的能源和營養元素，以及為植物生長提供必要微量元素等。

在太陽光照射下，水體中溶解性有機質的結構和性質均會發生大幅度改變，并生成甲酸、乙酸、丁二酸等小分子有機物[6-7]，其本身生物可利用性也可能會發生顯著變化，這將對水生生態系統中物質和能量循環產生極為重要的影響。然而，HA等有機質的生物可利用性受光照條件的影響至今未形成共識。Bittar等對藻源有機質生物可利用性受光照的影響進行了研究，結果顯示光照能顯著降低該類有機質的生物可利用性[8]；然而，Senga等在研究陸源有機質生物可利用性受光照條件影響時卻得到了完全相反的結論，并且他們指出光照對有機質生物可利用性的改變可能與其來源有關[9]。同時，微生物是水生生態系統中有機碳各種生物地球化學過程中最具活力的參與者，其活動過程能顯著利用或改變有機碳的種類、組成和性質。因此，本文擬以稻田土壤微生物為受試生物，對光照影響溶解性HA的生物可利用性進行深入探究，從而為溶解性HA的生物地球化學行為與效應研究提供基礎信息。

2 材料與方法

2.1 樣品采集及預處理

稻田土壤樣品采集自四川蒼溪(E 105°58′46″、N 31°42′47″，2017年10月)，均為5cm以下的土壤部分。手工剔除動植物殘體后，一部分新鮮土壤用于微生物接種液制備，另一部分土壤風干后避光保存，用于腐殖酸提取。

2.2 微生物接種液及HA制備

將新鮮土壤于室溫下活化3天，按10∶1(v/w)比例加入去離子水振蕩混勻，靜置過夜后離心獲取上清液，將其稀釋至溶解性有機碳濃度低于儀器檢測限，即獲得微生物接種液。

按前期研究建立的方法提取HA，并制備HA儲備液和工作液[10]，獲得的HA固體和溶液均避光保存于4°C下。

2.3 腐殖酸光照實驗

配制濃度為200.0mgC/L的HA工作液，調節pH=7.5±0.2后于光化學反應儀上進行光照。實驗溫度為25.0±0.5°C，并保持各反應器與空氣相通。于0、8、16、24和48小時取樣，分別標記為HA0、HA8、HA16、HA24和HA48。將獲得的部分HA樣品進行冷凍干燥，剩余部分于4°C下保存備用。

2.4 生物可利用性實驗

配制微生物生長基質溶液，每升溶液中礦物鹽的含量如下：100.0mg K2HPO4·12H2O、100.0mg KH2PO4、40.0mg NaCl、50.0mg NH4Cl、100.0mg MgSO4和50.0mg CaCl2·2H2O。采用滅菌的基質溶液配制微生物生長液，使HA濃度為20.0mgC/L，并向各生長液加入500μL微生物接種液。接種好的反應體系于好氧黑暗條件下培養72h，并于設定時刻下測定各培養體系光密度。

2.5 測試表征與數據分析

光照前后，HA濃度由總有機碳分析儀測定、吸光特性采用紫外-可見(UV-vis)分光光度計測試(測試HA濃度為5.0mgC/L)、組成和結構變化由元素分析和紅外光譜確定，HA生物可利用性高低由微生物生長量(培養液光密度，OD680)指示。

3 結果與討論

3.1 HA光學特性變化

如圖1所示，隨光照時間增加，HA的UV-vis吸光能力逐漸減小，這可能是由HA光礦化及其光吸收官能團破壞導致。為了驗證這一猜想，實驗測定了HA溶液TOC隨光照時間的變化，結果顯示光照并未引起HA溶液TOC的明顯變化。與HA0相比，HA48的TOC僅降低了3.6%。因此，光吸收官能團受損是HA吸光能力減弱的主要原因，這與Sharpless等研究光氧化改變腐殖酸電化學特性時所發現的結果相一致[11]。

圖1 光照對HA吸光能力的影響Fig.1 Influence of light irradiation on HA absorbance

盡管不同光照程度HA的UV-vis吸收光譜十分相似，各HA吸光能力均隨波長增大呈指數模式減小，但其吸收光譜特征指數能在一定程度上反映光照對HA的組成和結構的改變情況。如表1所示，E2/E3值大小與HA結構中的電子轉移復合結構豐度密切相關，隨電子轉移復合結構含量增加而減小[12]。因此，HA光吸收能力隨光照時長增加而減小的變化趨勢也與其電子轉移復合體結構受損程度相關[13]。光譜斜率(S275-295)、光譜斜率比(SR)及特征紫外吸收系數(SUVA254)均與HA的分子量大小和芳香度成反比[14-15]，因此光照導致了HA的芳香度和分子量減小。

表1 HA光吸收特征指數Tab.1 Light absorption characteristics of the HA

3.2 HA組成和結構改變

為了進一步確認UV-vis吸收光譜所指示的HA組成及結構變化，實驗對各HA樣品進行了元素組成分析。如表2所示，隨光照時長增加，HA的碳元素含量比例有所增加，而氧元素含量比例有所減小，這與HA中羧酸組分光礦化過程相關[14]。原子比H/C隨光漂白過程有增大的趨勢，表明HA中芳香性組分相對含量減少，脂肪性組分相對含量增加。這與UV-vis光譜分析的結果相一致，即光照過程中HA的芳香性組分會不斷減少。原子比O/C和(O+N)/C隨光照過程呈現出先增大后減小的變化趨勢，這表明HA的極性先增大后減小，這些變化均與HA先被分解成有機酸然后被礦化的過程密切相關[7]。

表2 不同光照時長HA的組成及原子比Tab.2 Composition and atomic ratios of HA under different light duration

圖2 不同光照時長HA的FTIR光譜Fig.2 FTIR spectra of HA with different light duration

各HA樣品的FTIR表征結果如圖2所示。隨光照時長增加，-OH響應(3 400cm-1)不斷減弱，而-COOH響應(1 662cm-1)呈現先增強后減弱的變化趨勢，這可能是HA中氧元素比例隨光照時長增加先增大后減小的原因。同時，這些官能團響應也與Polak等對溶解性HS紅外光譜分析結果一致[16]。與H/C值變化趨勢一致，-CH3和-CH2-響應(1 450cm-1和1 372cm-1)也呈現出不斷增強的變化趨勢。因此，隨光照時間增加，HA組成中會累積脂肪類物質，其生物可利用性可能會有所增加。

3.3 光照對HA生物可利用性的改變

如圖3所示，原始HA幾乎不能為微生物生長提供條件，培養前后溶液TOC僅減小了8.5%左右，但光照能顯著增加HA溶液的微生物可利用性(p<0.05)，其TOC減小了31%～52%不等。相應地，HA0-微生物體系的光密度無顯著變化(p>0.05)，而光照HA-微生物培養體系的光密度增大了1.38～2.05倍。盡管前期研究指出，光化學反應會與微生物生長過程競爭溶解性有機質中的碳源物質[17]，但HA光分解的同時也會生成微生物不穩定性碳，而這部分有機碳能為微生物生長提供有利條件。因此，與HA0相比，微生物能在光照HA溶液中良好生長。

圖3 不同HA-微生物培養體系的光密度及TOC含量Fig.3 Optical density and TOC contents of different HA-microbe incubation systems

各光照HA中，HA16具有最高的生物可利用性，這與各HA元素組成及官能團變化趨勢基本一致。盡管HA8具有最高的氧含量，但其碳含量相對較低，因此其生物可利用性低于HA16，這與Goldstone等的研究結論一致，即光分解腐殖質產生的有機酸并不是微生物生長的主要碳源[7]。因此，光照HA產生的脂肪性有機碳是其生物可利用性增大的主要原因。微生物培養后的原始HA和光照HA的UV-vis光譜分析結果如圖4所示，與圖1相比可知，對長波光敏感的HA組分也是微生物生長優先利用的有機物組分。因此，生物可利用性從HA16開始下降的主要原因是生物可利用性有機碳發生了光化學降解。

圖4 各HA微生物培養后的紫外-可見吸收光譜Fig.4 UV-vis absorption spectra of various HA microorganisms after culture

4 結 論

4.1 光照過程中，HA主要生成了小分子有機物，包括脂肪性有機物和有機酸等，僅小部分發生了光礦化過程；同時，HA的腐殖化程度和芳香化程度隨光照時長增加逐漸減小，氧元素比重先增大后減小，而碳元素比重先減小后增大。

4.2 光化學轉化能顯著增加HA的微生物可利用性，生成的小分子脂肪性有機物是光照增強HA生物可利用性的主要原因，但HA中對長波光敏感的組分也是微生物生長優先利用的部分，因此光照對HA微生物可利用的增強作用與光照時長相關。