Morris水迷宮實驗測試谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型認知障礙的相關(guān)研究

孔祥如，修蕓

1.重慶醫(yī)科大學兒科學院腫瘤外科，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學生命科學研究院,重慶 400014

認知障礙（缺陷）是精神分裂癥的核心癥狀之一，但目前抗精神病藥物對改善認知障礙癥狀大都效果不佳。建立穩(wěn)定可靠的具有預測效應的精神分裂癥認知障礙動物模型[1]將為精神分裂癥的研究創(chuàng)造條件。研究表明NMDA受體拮抗劑可誘發(fā)出精神分裂癥的陽性癥狀、陰性癥狀和認知能力下降的癥狀[2-3]。該研究于2016年9月—2017年9月在重慶國家生物產(chǎn)業(yè)基地實驗動物中心采用C57BL/6J小鼠長期腹腔注射NMDA受體拮抗劑MK-801制備精神分裂癥認知障礙小鼠模型，通過Morris水迷宮測試的相關(guān)指標，探討谷氨酸功能低下小鼠模型在精神分裂癥認知障礙方面的的行為學改變。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

動物來源：重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，周齡為8周齡，雄性小鼠48只，隨機分為MK-801慢性給藥模型組及對照組，每組12只；小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為：21～22℃的恒溫房間且每隔12 h調(diào)節(jié)光暗。

1.2 藥物及給藥方法

(+)-MK-801 hydrogen maleate購自美國Sigma公司（產(chǎn)品編號：M107），用生理鹽水稀釋成濃度為5 mg/mL液體，然后每日根據(jù)腹腔注射的濃度進行配比。Ⅰ組濃度為 0.25 mg/mL、II組濃度為 0.5 mg/mL、III組濃度為 0.01 mg/mL，進行腹腔注射，對照組小鼠給予等量生理鹽水腹腔注射。藥物注射持續(xù)14 d，前8 d藥物注射時間為每日上午10：00-11：00，第9～14天藥物注射時間為每日下午1：00-2：00

1.3 水迷宮測試步驟

水迷宮測試時間為第9～15天（每日上午8:30-12:00）。該次實驗分為兩部分：隱匿平臺獲得實驗及空間探索實驗。隱藏平臺獲得實驗：將小鼠置于水迷宮的房間適應半小時，每只小鼠每天均訓練4次，面向池壁將小鼠從東、南、西、北4個方向放入水中，記錄小鼠的逃避潛伏期；在60 s內(nèi)還未找到平臺，將小鼠引至平臺，并記錄逃避潛伏期為60 s。最后都讓小鼠在平臺停留15 s，根據(jù)東、南、西、北4個方向的參照物進行學習、記憶。空間探索實驗：訓練第7天將平臺撤出，選擇入水點2個，把小鼠放入水中60 s，測量：目標象限滯留時間、游泳路程及速度。

1.4 統(tǒng)計方法

應用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件一般線性模型(general linear model,GLM)的repeated measures和multivariate過程對定位航行實驗數(shù)據(jù)進行重復測量方差分析和多元方差分析,并進行不同時間點 （Bonferroni法）和不同組間（LSD）的兩兩比較。空間探索實驗數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，檢驗水準α為0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 隱匿平臺獲得實驗（定位航行實驗）

經(jīng)過6 d尋找隱藏平臺的訓練，各組動物的逃避潛伏期均隨著訓練天數(shù)的增加迅速下降 (圖1-A)：球形檢驗(Mauchly’s Test of Sphericity)的結(jié)果表明訓練6 d期間重復測量數(shù)據(jù)之間存在高度相關(guān)性 （F=127.361，P＜0.001），但時間（訓練天數(shù)）和分組的交互作用差異無統(tǒng)計學意義(F=1.146，P=0.337)。MK-801處理因素分析顯示，各組間動物的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義 （F=0.761，P=0.522）。但組間兩兩比較顯示，訓練第3天，1 mg/kg MK-801劑量組小鼠逃避潛伏期顯著高于對照組小鼠（圖1-B）。對照組及0.5 mg/kg MK-801劑量組分別于訓練第3天和第2天出現(xiàn)逃避潛伏期的顯著性減少并維持在此水平 （提示學習能力的顯著性提升），但0.25 mg/kg和1 mg/kg MK-801劑量組則均在第4天逃避潛伏期才較前1 d顯著性降低（見表1）。

2.2 撤平臺實驗（空間探索實驗）

各組動物間穿越平臺次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.882），各組動物在目標象限停留時間最多，但組間差異無統(tǒng)計學意義 （P=0.864），各組間動物的游泳速度 （P=0.478）差異均無統(tǒng)計學意義 （圖 1-C、D、E）。

圖1 不同劑量MK-801組小鼠Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)（實驗一，均值 ±標準誤）A-B、（空間記憶采集）隱匿平臺逃避潛伏期；C-E、(空間探索實驗）C-目標象限停留時間；D-穿臺次數(shù)；E-平均泳速。

表1 各組小鼠不同訓練天數(shù)逃避潛伏期的差別[（±s），s]

表1 各組小鼠不同訓練天數(shù)逃避潛伏期的差別[（±s），s]

注：* 較前 1 d 比較，P＜0．05；#較訓練第 1 天比較，P＜0．05；△較對照組比較，P＜0．05。

訓練天數(shù)對照組（n=12）0．25 mg／kg 組（n=12）0．5 mg／kg 組（n=12）1 mg／kg 組（n=12）第1天第2天第3天第4天第5天第6天42.24±11.06 26.97±15.60（11.34±5.85）*#（10.49±3.88）#（9.31±3.05）#（7.73±3.79）#47.06±12.90 33.28±19.55（21.72±14．50）#（12.93±11.10）*#（8.32±3.43）#（7.44±3.02）#43.88±11.36（24.59±14.41）*#（12.34±5.48）#（11.58±5.69）#（6.56±2.48）#（6.43±1.93）#40.47±12.03 28.87±16.63（21.60±18.42）*△（14.08±14.48）*#（11.26±13.33）#（9.06±8．04）#

表2 對照組和1 mg/kg組小鼠不同訓練天數(shù)逃避潛伏期的差別（±s）

表2 對照組和1 mg/kg組小鼠不同訓練天數(shù)逃避潛伏期的差別（±s）

注：* 較前 1 d 比較，P＜0．05；# 較訓練第 1 天比較，P＜0．05；△較對照組比較，P＜0．05。

組別對照組(n=12）1mg／kg組(n=12）逃避潛伏期第1天 第2天 第3天 第4天27.86±12.08（40.23±9.20）△20.11±10.95（26.20±14.46）*#22.47±14.01（24.94±14.10）#19.18±12.38（21.04±12.38）#

圖2 MK-801及對照組小鼠Morris水迷宮實驗數(shù)據(jù)（實驗二，均值±標準誤）A、（空間記憶采集）隱匿平臺逃避潛伏期；B、(空間探索實驗）從左至右分別為目標象限停留時間、穿臺次數(shù)和平均泳速。

3 討論

精神分裂癥患者常表現(xiàn)出典型的妄想、幻覺及社交退縮、情感淡漠、意志減退或認知障礙。由于病因及癥狀的復雜性，加之妄想、幻覺等癥狀在動物身上很難模擬和量化[4]。NMDA受體拮抗劑制備的精神分裂癥動物模型因能誘發(fā)出更全面的精神分裂癥的陽性癥狀、陰性癥狀和認知能力下降的癥狀,同時能復制精神分裂癥的誘發(fā)因素并對已知有效的治療方法做出評估，正被廣泛的應用于精神分裂癥病因機制的研究中[5]。Morris水迷宮是由英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計并應用于學習記憶腦機制研究的，目前Morris水迷宮已成為檢測實驗動物學習記憶水平的重要工具實驗之一。該研究中，我們采用NMDA受體拮抗劑MK-801連續(xù)2周腹腔注射的方法來制備精神分裂癥小鼠模型。實驗采用了0.25 mg/kg,0.5 mg/kg和1 mg/kg 3個劑量，結(jié)果顯示，MK-801各劑量組小鼠在注射急性期（注射30 min內(nèi)）均有自發(fā)性活動增加，1 mg/kg劑量組小鼠還出現(xiàn)后肢功能障礙和共濟失調(diào)的現(xiàn)象（錄像示），該現(xiàn)象1 h后消失，這與王瀚等[6]的研究結(jié)果一致，實驗組與對照組小鼠相比逃避潛伏期延長分別為 (61.5±6.3)s、(37.6±6.0)s。 此外，MK-801 注射第 9 天，MK-801組小鼠可見平臺逃避潛伏期時間顯著高于對照組小鼠，這與胡志紅等[7]的研究結(jié)果一致，注射一周左右，平臺逃避潛伏期時間對照組為（20.13±11.49）s,實驗組為（37.73±43.15)s,提示精神分裂癥小鼠模型制備的成功。但定位航行：各組小鼠逃避潛伏期均隨訓練天數(shù)的增加而下降，訓練第4天4組小鼠逃避潛伏期分別為 （42.24±11.06）s、（47.06±12．90）s、（43.88±11.36）s、（40.47±12.03）s，而第六天下降為 （7.73±3.79）s、（7.44±3.02）s、（6.43±1.93）s、（9.06±8．04）s， 但各組間動物的逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學意義(F=0.761，P=0.522）；兩兩比較：訓練第 3 天，1 mg/kg MK-801劑量組小鼠逃避潛伏期 （21.60±18.42）s顯著高于對照組小鼠（11.34±5.85）s（F=127.361，P＜ 0.001）；空間探索：各組小鼠間穿臺次數(shù)、目標象限停留時間、平均游泳速度及游泳總路程差異均無統(tǒng)計學意義。

綜上所述，該研究提示Morris水迷宮傳統(tǒng)實驗設計不易評估MK-801（NMDA受體阻斷）誘導的谷氨酸功能低下精神分裂癥小鼠模型的認知障礙。如研究者們擬采用Morris水迷宮對此類小鼠模型進行學習記憶能力 （或認知能力）的評估，應設計或采用更為敏感的方案及指標。