實驗猴間日瘧原蟲感染的血清學(xué)調(diào)查

何紫薇 張玉林 吳 杰 杜娟娟 楊建發(fā) 楊國琴

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，云南省高校獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，昆明，650201；2.中國科學(xué)院昆明動物研究所，昆明，650201；3.滇西科技師范學(xué)院，臨滄，677000)

瘧疾(Malaria)是由瘧原蟲(Plasmodiumspp.)經(jīng)按蚊傳播引起的一種世界性分布、對人危害極為嚴重的人獸共患寄生蟲病，已成為全球廣泛關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題之一。瘧原蟲種類較多，已知約150種，主要寄生于人和哺乳動物，少數(shù)寄生于鳥類和爬行動物[1]。寄生于人體的瘧原蟲主要有4種，即惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodiumvivax)、卵形瘧原蟲(Plasmodiumovale)和三日瘧原蟲(Plasmodiummalariae)，它們分別導(dǎo)致惡性瘧疾、間日瘧疾、卵形瘧疾和三日瘧疾[2]。在4種瘧疾寄生蟲中，間日瘧原蟲的地理分布最為廣泛，在亞洲、中美洲和南美洲、中東、大洋洲和東非都有間日瘧流行[3-4]。2015年全球間日瘧病例約138萬例，占全球瘧疾病例總數(shù)的25%—40%[5]，間日瘧原蟲是第二大瘧疾流行物種，因此間日瘧原蟲很可能成為瘧疾的主要威脅[6]。

云南由于特殊的地域和氣候特點，成為了我國瘧疾流行地區(qū)之一。有調(diào)查表明，云南間日瘧原蟲IgG抗體血清流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果中女性為9.98%，男性為10.79%[7]。

猴通常作為人類疾病的模型動物，關(guān)于非人類靈長類實驗動物間日瘧原蟲感染情況的流行病學(xué)調(diào)查在云南地區(qū)尚未報道[8-9]。本調(diào)查對象主要包括恒河猴(Macacamulatta)、豚尾猴(Macacanemestrina)和食蟹猴(Macacafascicularis)3種實驗猴。通過采集猴血液為樣本進行ELISA檢測，初步了解該研究中心實驗猴間日瘧原蟲感染情況，為獼猴屬動物或其他非人類靈長類實驗動物間日瘧原蟲病的防治提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

恒河猴、豚尾猴、食蟹猴3種實驗獼猴血清均于2017年11月至2018年5月采自云南省昆明市某靈長類研究中心(216只單籠飼養(yǎng)，277只群體飼養(yǎng))。

1.1.2 主要試劑

猴間日瘧原蟲(PLV)ELISA試劑盒，購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(MLBIO Biotechnology Co.，Ltd，Shanghai，China)，陽性對照和陰性對照均來自于該試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

采用靜脈采血的方法，每管采集3—4 mL前肢靜脈血至肝素納抗凝采血管，反復(fù)顛倒混勻，4℃保存。在實驗室內(nèi)，將采集到的血液血清分離，3 000 r/min離心5 min，分別得到的有效血清樣品有恒河猴血清319份，豚尾猴血清89份，食蟹猴血清85份，共獲得493份血清樣品。

1.2.2 間日瘧原蟲酶聯(lián)免疫分析

參照猴間日瘧原蟲(PLV)ELISA試劑盒說明書，應(yīng)用雙抗體夾心法檢測猴血清樣本中的間日瘧原蟲抗原。計算和結(jié)果判定：只有當(dāng)陽性對照孔平均值≥1.00，陰性對照平均值≤0.10時為有效試驗，才可對待測血清結(jié)果進行判定。臨界值(CUT OFF)計算：臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。判定待檢測血清樣品，OD值<臨界值為間日瘧原蟲陰性，OD≥值臨界值為間日瘧原蟲陽性。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用χ2檢驗分析獼猴不同品種，性別和年齡間在間日瘧原蟲感染情況上的差異，并對獼猴感染間日瘧原蟲風(fēng)險因素進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3種獼猴感染間日瘧原蟲的血清陽性率

本次調(diào)查樣品均來自云南昆明某靈長類研究中心，共檢測有效獼猴血清樣本493份。其中，恒河猴319份，ELISA檢測為陽性的有3份，血清陽性率為0.94%；豚尾猴89份，ELISA檢測為陽性的有5份，血清陽性率為5.62%；食蟹猴85份，檢出率最低為0%，統(tǒng)計3種獼猴間日瘧原蟲血清陽性率平均為1.62%(表1)。

表1 不同品種的實驗猴間日瘧原蟲感染的血清陽性率

Tab.1 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different species of experimental monkeys

2.2 不同性別的實驗猴間日瘧原蟲感染的血清陽性率

從性別上分析，493份猴血清樣本中包括公猴樣本173份，母猴樣本320份。ELISA檢測結(jié)果顯示公猴感染間日瘧原蟲陽性樣本有5份，母猴感染間日瘧原蟲陽性樣本有3份，公猴和母猴的血清陽性率分別為2.89%和0.94%(表2)。

表2 不同性別的實驗猴間日瘧原蟲感染的血清陽性率

Tab.2 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different sexes of experimental monkeys

2.3 不同年齡的實驗猴間日瘧原蟲感染的血清陽性率

從年齡上分析，493份血清樣本中包括了1—24歲不同年齡段的實驗猴，其中青年猴(≤4歲)樣本有261份，成年猴(>4歲)樣本有232份。ELISA檢測結(jié)果顯示，青年猴感染間日瘧原蟲陽性樣本有8份，血清陽性率為3.07%，而在成年猴里沒有發(fā)現(xiàn)間日瘧原蟲感染(表3)。

表3 不同年齡的實驗猴間日瘧原蟲感染的血清陽性率

Tab.3 Seroprevalence of Plasmodium vivax in different ages of experimental monkeys

2.4 不同品種、性別和年齡的實驗猴感染間日瘧原蟲的差異分析

應(yīng)用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用卡方檢驗分析不同品種，性別和年齡的實驗猴在間日瘧原蟲感染情況上的差異。結(jié)果表明，不同品種的實驗猴感染間日瘧原蟲的血清陽性率不同，存在顯著差異(χ2=11.213，P<0.05)；不同性別的實驗猴感染間日瘧原蟲的血清陽性率不存在顯著差異(χ2=2.682，P>0.05)；而不同年齡的實驗猴感染間日瘧原蟲的血清陽性率不同，存在顯著差異(χ2=7.228，P<0.05)(表4)。

表4 實驗猴不同品種、性別和年齡感染間日瘧原蟲χ2檢驗結(jié)果

Tab.4 Results of χ2 test of Plasmodium vivax in different varieties，sexes and ages of experimental monkeys

2.5 實驗猴間日瘧原蟲感染風(fēng)險分析

本實驗對云南昆明某靈長類研究中心實驗猴間日瘧原蟲感染風(fēng)險因素進行了多元邏輯回歸分析，將是否感染間日瘧原蟲作為因變量，品種、性別、年齡3個因素作為自變量，但由上述卡方檢驗結(jié)果(表4)已得出，實驗猴的性別差異不顯著(P>0.05)，不必進行邏輯回歸分析。簡單從血清陽性率來看，青年猴(3.07%)感染間日瘧原蟲的風(fēng)險要明顯大于成年猴(0%)；從回歸分析結(jié)果來看，品種因素是引起實驗猴感染間日瘧原蟲的主要風(fēng)險因子(P=0.004<0.05)。以恒河猴為參考，豚尾猴(OR=6.270，95%CI=1.469-26.770，P=0.047<0.05)更易感染間日瘧原蟲病。而食蟹猴感染間日瘧原蟲的風(fēng)險要低于恒河猴(P=0.084>0.05)(表5)。

表5 實驗猴間日瘧原蟲感染風(fēng)險多元邏輯回歸分析結(jié)果

Tab.5 Results of logistics regression analysis of the risk of infection of Plasmodium vivax in experimental monkeys

3 討論

3.1 不同品種和年齡的實驗猴間日瘧原蟲感染差異性原因分析

獼猴屬(Macaca)動物作為醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究領(lǐng)域中日益廣泛使用的實驗動物，寄生蟲的感染不僅影響動物的飼養(yǎng)繁殖以及實驗動物標(biāo)準(zhǔn)工作，而且直接關(guān)系到科學(xué)實驗結(jié)果的準(zhǔn)確獲得[10]，此外，間日瘧原蟲為人猴共患寄生蟲。雖然人和動物的瘧原蟲一般不發(fā)生交叉感染，即人的瘧原蟲不感染動物，動物的瘧原蟲也不感染人。但在實驗室內(nèi)偶有例外，曾出現(xiàn)寄生于猴、黑猩猩(Pantroglodytes)的瘧原蟲感染人，三日瘧原蟲感染黑猩猩和夜猴(Aotustrivirgatus)[11]。因此對實驗猴感染間日瘧原蟲的血清學(xué)調(diào)查對相關(guān)的工作員和實驗動物來說都具有十分重要的公共衛(wèi)生意義。

本次血清學(xué)調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)，493份實驗猴血清樣本中判定出有8份為間日瘧原蟲抗原陽性，血清陽性率約為1.62%，造成感染的原因跟實驗猴的來源和飼養(yǎng)環(huán)境有很大的關(guān)系。據(jù)了解，該靈長類研究中心飼養(yǎng)的猴大部分都是自繁殖而來，每年投喂2次伊維菌素，實驗猴的飼養(yǎng)環(huán)境主要是平房式猴舍(三面墻一面鐵欄朝外)，通風(fēng)條件較好。猴舍周圍是大片草坪和綠植，背面靠山，環(huán)境優(yōu)美，但由于飼養(yǎng)環(huán)境地處于山林周圍，并且緊挨著一條排水溝，一到秋夏季節(jié)蚊蟲較多的時候，便為其提供了一個較好的滋生環(huán)境。猴舍四周也沒有專用的防蚊裝置，因此就增加了攜帶有間日瘧原蟲的蚊蟲傳播病原的機會。

不同品種和年齡的實驗猴感染間日瘧原蟲的血清陽性率存在顯著差異。其中豚尾猴的血清陽性率最高，食蟹猴中則無間日瘧原蟲感染。青年猴的血清陽性率也明顯高于成年猴。這種差異的出現(xiàn)可能與不同品種實驗猴的生活習(xí)性不同或是體質(zhì)差異有關(guān)，也可能隨著年齡的增長，成年猴自身免疫力相對較強，對間日瘧原蟲的抵抗力也逐漸增強，相對于4歲及以下的幼年和青年猴，成年猴感染間日瘧原蟲的風(fēng)險更低。從飼養(yǎng)管理的角度來看，分為單籠飼養(yǎng)和群體飼養(yǎng)兩種方式，不難發(fā)現(xiàn)在這8只感染間日瘧原蟲的陽性猴中，有6只都是單籠飼養(yǎng)，其余2只群體飼養(yǎng)，日常飼料都是以自制蒸糕為主。由于單籠飼養(yǎng)的猴活動范圍受限，靜止?fàn)顟B(tài)時更容易招引蚊蟲的叮咬，而群養(yǎng)的猴活動范圍比較寬闊，整體也更為活躍，不太容易吸引蚊蟲。由此我們可以懷疑，差異的出現(xiàn)也可能是由于飼養(yǎng)管理的不同所導(dǎo)致。

感染間日瘧原蟲的8只猴并沒有表現(xiàn)出明顯的間日瘧疾臨床癥狀，間日瘧原蟲在人和動物體內(nèi)的存活時間通常為2年，部分可長達5年[12]。而猴在感染瘧原蟲后，通常要經(jīng)過一段時間才表現(xiàn)出臨床癥狀[13]，這8只猴很有可能是輕度感染者，可成為帶蟲者而無明顯的臨床癥狀，同時也是潛在的內(nèi)部感染源[14]，應(yīng)引起飼養(yǎng)人員的重視，重點觀察這8只猴的日常精神狀態(tài)，并與其他猴隔離飼養(yǎng)。

3.2 當(dāng)前感染風(fēng)險分析及防治建議

由間日瘧原蟲感染引起的疾病問題往往容易被人忽視，曾有調(diào)查顯示，這種寄生蟲每年導(dǎo)致大約1億—3億個臨床病例[15]。在非洲以外，間日瘧原蟲占所有瘧疾病例的50%，由于間日瘧原蟲流行的大多數(shù)地區(qū)瘧疾傳播率較低，受影響的人群對該寄生蟲的免疫力很弱[16]，該問題在實驗猴身上同樣也不可忽視。對于日常飼養(yǎng)管理實驗猴的工作人員來說，并不是沒有感染的可能。帶蟲的猴都會成為潛在的內(nèi)部感染源，叮咬了帶蟲猴的蚊子再次叮咬人后，便會把子孢子順理成章地注入到人體內(nèi)，入侵肝臟細胞，對人體健康造成危害。早期國內(nèi)就有研究者采用薄片法，取猴外周血制成血膜薄片，用吉姆薩染色并在高倍鏡下觀察到猴瘧原蟲感染。血片中常見裂殖體和配子體時期，多見于我國豚尾猴中，恒河猴中亦有發(fā)現(xiàn)[17-18]。猴感染瘧原蟲后會出現(xiàn)厭食，反應(yīng)遲鈍，體質(zhì)消瘦，面色蒼白，有時還伴有猴血尿[19]。對此我們應(yīng)引起重視，并提醒從事實驗動物繁育工作或是動物園的飼養(yǎng)人員，制定一套科學(xué)健康的飼養(yǎng)管理方案，加強間日瘧原蟲的防治工作。可在猴舍安裝紗門、紗窗等，以減少蚊子對實驗猴的叮咬，并適時安排驅(qū)蟲，提高實驗猴質(zhì)量。工作人員自身也要做好相應(yīng)的防蚊工作，比如使用蚊帳、點驅(qū)蚊藥片或蚊香，在身體外露部分涂抹驅(qū)蚊膏。最后做好綜合防制，保持猴舍和人員居住區(qū)周圍環(huán)境的干凈整潔，疏通積水，在下水道經(jīng)常噴殺蟲藥，以消滅蚊蟲滋生環(huán)境。