桑葉乙醇提取物的體外抗氧化與抑菌活性

高欣妍， 王海英*， 劉志明

(1.東北林業大學 林學院， 黑龍江 哈爾濱150040； 2.東北林業大學 材料科學與工程學院， 黑龍江 哈爾濱150040)

桑(MorusalbaL.)是一種多年生落葉喬木或灌木，蕁麻目?？粕?Morus)[1]。桑作為具有經濟效益的古老樹種之一，不斷被人類篩選并培育。桑屬有約16種，我國約有11種，常見并普遍利用的包括雞桑、魯桑、山桑等幾個桑種，東北、西南和西北各省均有桑樹種植基地[2-3]。桑葉、桑椹、桑白皮、桑枝、桑木等均可利用。其中，桑葉為國家衛生部藥食同源名錄的品種，來源于植物桑(M.alba)[4-6]，桑葉在飲品方面可做桑葉茶、桑葉飲料等[7-8]，目前市場上還有桑葉米酒和桑葉啤酒等酒制品[9]，在食用方面，桑葉還被制成桑葉鮮菜和桑葉菜干銷售[10]。桑葉含有生物堿類化合物、黃酮類化合物、多糖類化合物等，具有降血脂、降血糖、抗氧化、抑菌和增加機體免疫力等功效[11-13]，因此也被應用于保健品和藥物中，用于治療糖尿病和防治粥樣動脈硬化等疾病[14-15]。薛婷婷等[16]采用乙醇浸提法提取新鮮桑葉中的1-脫氧野尻霉素，較佳提取工藝條件為乙醇體積分數65%，pH值3.5，料液比1∶11(g∶mL)，水浴溫度55 ℃，經檢測此方法獲得的桑葉提取物中1-脫氧野尻霉素質量濃度為0.028 g/L，1-脫氧野尻霉素得率為0.065%。桑葉提取物作為一種純天然植物原料，具有抗氧化與抑菌活性良好的優點，本研究以桑葉為原料，乙醇為溶劑，測定桑葉乙醇提取物的體外抗氧化活性以及對3種常見細菌的抑菌活性，以期為桑葉中活性物質的利用提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

干桑葉由黑龍江省齊齊哈爾市甘南縣甘南林場桑產業科技示范園提供，研磨過篩，取粒徑≤0.30 mm的部分，備用。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)均由東北林業大學實驗室提供。

甲醇，色譜純；鐵氰化鉀、三氯化鐵、三氯乙酸、二苯基苦基肼自由基(DPPH·)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、無水乙醇、氯化鈉均為分析純。

722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；索氏提取裝置，定制；RE-2000A型旋轉蒸發儀，鞏義市予華儀器有限責任公司；7890A-7000B型氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.2 桑葉乙醇提取物的制備和GC-MS分析

稱取5 g干桑葉粉末于圓底燒瓶中，加入50 mL體積分數70%的乙醇，70 ℃水浴回流浸提3 h，過濾殘渣，45 ℃、0.9 kPa條件下旋轉蒸發，減壓蒸餾回收乙醇至質量恒定，得到提取物浸膏，稱量所得提取物質量，計算得率。用甲醇將桑葉乙醇提取物配制成10 mg/L的甲醇溶液，利用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用儀對試樣進行分析，色譜和質譜分析條件如文獻[17]所示。真空干燥剩下的提取物浸膏得到桑葉乙醇提取物粉末，密封，4 ℃冷藏，備用。

1.3 桑葉乙醇提取物抗氧化實驗

1.3.1鐵離子還原的總還原力測定 根據文獻[18]記載，還原性物質會將鐵氰化鉀還原，并與三價鐵離子形成普魯士藍，普魯士藍合成量越大，則表明還原性越強。普魯士藍在紫外光700 nm處有吸收峰，因此吸光度與還原性強度成正比，吸光度越大，則表示還原性越強。取1 mL不同質量濃度(4.8、3.6、2.4、1.2、0.6、0.3、0.15和0.075 g/L)的桑葉乙醇提取物樣液于試管中，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH值6.6)和2.5 mL 質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液，混勻后于50 ℃水浴保溫20 min，快速冷卻，再加入2.5 mL 質量分數為10%的三氯乙酸，離心，取上清液2.5 mL加入干燥試管，再依次加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL 質量分數0.1%的三氯化鐵試劑，充分混勻，倒入比色皿，采用紫外分光光度計在700 nm下測吸光度值(無水乙醇作空白調零)。每個濃度平行操作 3 次，記錄吸光度值，取平均值?？箟难嶙鳛殛栃詫φ战M，設置8組質量濃度梯度，分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0和4.0 g/L。

1.3.2DPPH自由基清除能力測定 向試管中移取 2 mL不同濃度的桑葉乙醇提取物樣液，加入2 mL濃度為0.1 mmol/L的DPPH·試劑，混勻后常溫放置 15 min，轉入比色皿，測定517 nm下的吸光度值(Ai)。測量并記錄2 mL不同濃度樣液混合2 mL 無水乙醇的吸光度值(Aj)， 和2 mL 0.1 mmol/L DPPH·試劑混合2 mL 的無水乙醇的吸光度值(A0)。以 2 mL 蒸餾水與 2 mL無水乙醇混合液作空白對比。每個濃度測 3 次取平均值，抗壞血酸作為陽性對照組，濃度梯度同1.3.1節。根據以下公式計算不同濃度桑葉乙醇提取物對 DPPH·的清除率(RDPPH·)：

1.4 桑葉乙醇提取物抑菌實驗

1.4.1培養基的制備 分別取酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、瓊脂25 g于大燒杯中，加入適量蒸餾水，攪拌均勻，定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌(121 ℃時滅菌30 min)，趁熱倒入9 cm培養皿中，厚度5 mm，靜置凝固后備用。另取一份酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g，少量蒸餾水溶解，定容至1 000 mL，高壓蒸汽滅菌，制成液體培養基，用于培養菌液。

1.4.2菌懸液的制備 用超凈臺紫外燈滅菌30 min。取3個100 mL錐形瓶，裝入少量無菌的液體培養基，分別用接菌環均勻刮取少量已經活化2～3代的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌置于錐形瓶中，封口放入搖床，160 r/min晃動，混勻，制成含菌數約106～107CFU/mL的菌懸液。培養完成后，放在冰箱中備用。

1.4.3抑菌實驗及數據處理 采用濾紙片法和瓊脂平板擴散法進行抑菌實驗。將桑葉乙醇提取物配制為8個濃度梯度，將已滅菌的6 mm濾紙片分別放入8種濃度梯度的桑葉乙醇提取物樣液中浸泡1 h。移液槍取100 μL上述制備的菌懸液均勻涂抹在瓊脂平板表面，制成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種含菌平板。取浸泡過桑葉乙醇提取物的6 mm濾紙片貼在含菌平板上，每個培養皿各3片浸過同一種濃度樣液的濾紙片。以蒸餾水為空白對照組。將處理過的含菌平板置于恒溫箱中，溫度控制在37 ℃，培養24 h后，游標卡尺測量并記錄抑菌圈的直徑。整理數據制成表格，通過Excel和SPSS19.0計算半數抑制濃度(IC50)及顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 GC-MS分析

采用索氏提取法得到的桑葉乙醇提取物為淺綠色透明液體，得率為1.80%。桑葉乙醇提取物樣品的總離子流色譜圖如圖1所示，總GC含量90.99%的化合物被鑒定，共鑒定出9種化合物，通過面積歸一化法計算出各組分的GC含量，結果如表1所示。

表1 桑葉乙醇提取物GC-MS分析

從表1可知，桑葉乙醇提取物中主要包括酯類(82.85%)、烷烴類(6.31%)、芳烴類(1.62%)、醇類(0.21%)。其中，GC含量最高的為乙酸丁酯(81.55%)，其次為十一烷(6.09%)。

2.2 抗氧化活性分析

2.2.1總還原力測定 鐵離子還原法(FRAP法)測定總還原力的本質是測定樣品將Fe3+還原成Fe2+的能力，Fe2+絡合物在700 nm紫外光照射下有吸收峰，吸光度越大，反應出樣品總還原能力越強。桑葉乙醇提取物總還原力如圖2所示。

圖1桑葉乙醇提取物的總離子流色譜圖

Fig.1Totalioncurrentchromatogramofethanolextractfrommulberryleaves

圖2桑葉乙醇提取物總還原力

Fig.2Totalreducingpowerofethanolextractfrommulberryleaves

由圖2可見，吸光度值與桑葉乙醇提取物質量濃度呈現出良好的正向相關性，隨著桑葉乙醇提取物質量濃度的增加，總還原力隨之增大。通過Excel擬合曲線得到回歸方程為y=0.411 3x+0.364 1，相關系數(R2)為0.986 4。本次試驗中的陽性對照組抗壞血酸總還原力在0.1～1.0 g/L質量濃度區間內與其質量濃度呈良好的線性關系，擬合曲線為y=0.63 1x+2.450 6，R2為0.988 9，抗壞血酸在低質量濃度0.1 g/L時吸光度值為2.506，仍大于本次試驗中桑葉乙醇提取物最高質量濃度4.8 g/L時的吸光度值2.293。由數據可以看出桑葉乙醇提取物具有較好的還原能力，但仍弱于抗壞血酸。

2.2.2DPPH自由基和OH自由基清除能力 測定了桑葉乙醇提取物和抗壞血酸在體外對于常見的DPPH自由基和OH自由基的清除能力，結果如表2所示。

表2 樣品的自由基清除率

由表2可知，桑葉乙醇提取物對于DPPH自由基和OH自由基都有較好的清除能力，相同質量濃度下，桑葉乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力明顯高于OH自由基。根據表2數據顯示，桑葉乙醇提取物在質量濃度大于3.6 g/L時，對DPPH自由基的清除能力接近于完全清除。通過SPSS19.0統計計算，清除DPPH自由基和OH自由基的半數抑制濃度(IC50)分別為73.07和104.52 mg/L。本次對照實驗組中，抗壞血酸質量濃度為0.2 g/L時對DPPH自由基清除率即達到96.07%，質量濃度超過1.0 g/L時清除率均在99%以上，接近于完全清除，IC50為0.02 g/L；而對羥基自由基清除率稍弱，質量濃度為4.0 g/L時僅為59.90%，IC50為3.596 g/L。由此可見，桑葉乙醇提取物對DPPH自由基清除能力弱于抗壞血酸，而對羥基自由基的清除能力強于抗壞血酸。有待進一步研究。

2.3 抑菌活性分析

大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌屬于革蘭氏陽性菌，均是常見致病細菌。桑葉乙醇提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌3種供試菌的抑制情況如表3。抑制率通過如下公式計算：

相對抑菌率=(處理組抑菌圈直徑-空白組抑菌圈直徑)/處理組抑菌圈直徑×100%

由表3可知，桑葉乙醇提取物對于3種細菌均有一定抑制作用，隨質量濃度的增大，抑菌圈逐漸增大。通過SPSS19.0統計桑葉乙醇提取物與抑制率的關系，計算桑葉乙醇提取物對3種細菌的IC50，比較三者差異的顯著性。桑葉乙醇提取物對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的IC50值分別為4.824、6.806和14.382 g/L。結果顯示，桑葉乙醇提取物對枯草芽孢桿菌的抑制效果明顯高于對大腸桿菌的抑制效果，略高于對金黃色葡萄球菌的抑制效果。在桑葉乙醇提取物質量濃度為19.2 g/L時，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌直徑分別為(15.54±0.85)、(14.03±0.11)和(11.96±0.92) mm，在桑葉乙醇提取物質量濃度小于0.3 g/L時，對3種供試菌的抑制作用明顯減弱，幾乎沒有抑菌圈。

表3 桑葉乙醇提取物的抑菌活性

1)同行不同大寫字母表示差異顯著different uppercase letters in the same row indicated significant difference

3 結 論

3.1采用索氏提取法對干桑葉進行提取得到乙醇提取物，并對桑葉乙醇提取物的組分進行了研究。結果表明：桑葉乙醇提取物中含有多種有機物，主要包括酯類(82.85%)、烷烴類(6.31%)、芳烴類(1.62%)、醇類(0.21%)。其中，GC含量最高的為乙酸丁酯(81.55%)，其次為十一烷(6.09%)。

3.2對桑葉乙醇提取物的總還原力以及對DPPH自由基和OH自由基的清除能力與陽性對照的抗壞血酸相比，桑葉乙醇提取物的總還原力與清除DPPH自由基的能力較弱，清除OH自由基的能力較強，桑葉乙醇提取物其抗氧化活性與抑菌活性均與其質量濃度呈正相關。桑葉乙醇提取物質量濃度超過3.6 g/L時，DPPH自由基清除率達到99%，其IC50為73.07 mg/L；若要達到更高的羥基清除率，則需要更大的桑葉乙醇提取物濃度，其IC50為104.52 mg/L。

3.3對桑葉乙醇提取物的抑菌效果進行研究，結果表明：桑葉乙醇提取物對3種細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草牙孢桿菌)均表現出了一定的抑制作用，抑菌效果隨桑葉乙醇提取物質量濃度的增加而增強，抑制能力為枯草芽孢桿菌>金黃色葡萄球菌>大腸桿菌。桑葉乙醇提取物質量濃度19.2 g/L下，對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈最大，抑菌圈直徑分別為(15.54±0.85)、(14.03±0.11)和(11.96±0.92) mm。桑葉乙醇提取物對3種細菌的半數抑制濃度IC50分別為4.824、6.806和14.382 g/L。