草甘膦銨鹽暴露對烏龜胚胎發育、孵出幼體運動及學習表現的影響

胡英超，王杰，葉夢婷，黨偉，陸洪良

杭州師范大學生命與環境科學學院，生態系統保護與恢復杭州市重點實驗室，杭州 310036

草甘膦是全球范圍內普遍使用的一種非選擇性有機磷除草劑[1]。草甘膦制劑具有良好的水溶性，在田間被大規模施用。施用的草甘膦制劑大部分被快速降解，但殘余物以及降解代謝產物仍會滲透到土壤中，或通過地表徑流、田間排水系統等各種途徑進入水環境，對棲息于水環境中的生物以及居住于污染區域周邊環境中的其他動物及人體造成潛在危害。之前一些研究認為，草甘膦制劑對生態環境和生活于其中的生物毒害不大[2]。然而，近年來研究顯示，草甘膦制劑對生物和人體的危害不可忽視[3-4]。當水體環境中草甘膦超一定濃度時，就可能對包括魚類、兩棲類在內的水生動物具有潛在毒性，造成幼體生長延遲、性腺發育畸形以及激素信號傳遞受阻等情況[5-8]。草甘膦對水生動物毒性效應的研究主要集中于魚類[9-13]。雖然這些研究顯示的結果并不一致，但已表明草甘膦暴露對魚類的毒害作用是廣泛的[2]。從導致不同程度的DNA損傷的遺傳毒性到改變生理、形態、行為學特征或直接致死的毒性效應均有報道[5,9-13]。草甘膦的毒害作用可能不僅僅只發生在魚類和較低等水生無脊椎動物中，對其他高等水生和陸生脊椎動物亦可能產生影響。例如一些證據顯示，慢性低劑量草甘膦暴露與人類肥胖、不孕不育和癌癥等臨床疾病存在潛在關聯[14]。

動物的運動能力和行為表現被認為是與其適合度密切相關[15]。檢測受環境污染物脅迫作用下動物的運動行為反應是行為毒理學的主要內容，在一些魚類毒理研究中已得到了廣泛應用。阿特拉津、百草枯等農藥及其他污染物暴露會顯著影響斑馬魚(Barchydaniorerio)、日本青鳉(Oryziaslatipes)的運動行為表現[12,16-20]。例如，斑馬魚在氯化鎘、敵敵畏污染脅迫下行為反應過度活躍，而行為強度和活動深度下降[19]。爬行動物是許多水域及陸地生態系統的重要組成部分，然而涉及此類動物(尤其是水生或半水生的龜鱉類)毒理學方面的研究報道很少[21-28]。例如，胚胎期多環芳烴、草甘膦制劑暴露分別影響北美擬鱷龜(Chelydraserpentina)和紅耳滑龜(Trachemysscriptaelegans)的卵孵化成功率和孵出幼體表型[25-26]；水體中氯丹、二氯二苯三氯乙烷和多氯聯苯等農藥殘留可能潛在地改變紅耳滑龜、綠海龜(Cheloniamydas)等龜類的種群性比[22-23,29]。到目前為止，極少見有關于研究環境污染物暴露是否影響龜鱉類動物運動行為表現的報道[30]。本研究用不同濃度的草甘膦銨鹽處理孵化過程中的烏龜(Mauremysreevesii)卵，通過測定孵出幼體的個體大小、游泳能力和迷宮學習表現來評價草甘膦暴露對龜鱉類動物的潛在毒性效應。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗龜卵采集和草甘膦溶液配制

實驗用152枚烏龜卵于2014年7月中旬采購自海寧市龍頭閣兩棲爬行動物研究所。所有龜卵均當天收集，選取受精的龜卵后，放入裝有濕潤蛭石的泡沫盒內運回杭州實驗室內。在實驗室內，用Mettler-Toledo電子天平(型號：PB303-N，Mettler-Toledo儀器(上海)有限公司)稱重，用點光源確定龜卵胚胎位置，用HB中華牌鉛筆在胚胎位置的卵殼表面畫上記號，并在旁邊編上序號。

實驗用草甘膦銨鹽(C3H11N2O5P)樣品采購自浙江新安化工集團股份有限公司，草甘膦含量為68%。稱取適量固體草甘膦銨鹽加入一定量蒸餾水配制成2 000 mg·L-1的母液，然后在2 000 mg·L-1母液中加入蒸餾水分別稀釋10、100和1 000倍，以配制成200、20和2 mg·L-1的草甘膦銨鹽溶液。

1.2 卵孵化及處理

實驗設置一個對照組(蒸餾水0 mg·L-1)和4個不同草甘膦濃度(2、20、200和2 000 mg·L-1)的處理組。將卵隨機地分配于不同處理組。所有龜卵孵化于水勢約為-220 kPa的濕潤基質中(蛭石與水的質量比為1∶1)。等量的濕潤蛭石放在不同孵化盒中并鋪平，將龜卵近胚胎的一面朝上半埋于濕潤蛭石，孵化盒上覆有塑料薄膜以防止基質水分快速蒸發。所有含龜卵的孵化盒均放置于溫度為29 ℃(該溫度為烏龜胚胎發育的最適溫度，使卵孵出1∶1雌雄性比的幼體[31])的人工氣候室內。孵化過程中，每隔2 d對孵化盒稱重并及時補充基質水分以保持其濕度恒定。

每日上午8:00—10:00期間，用移液槍吸取100 μL相應濃度的暴露溶液均勻地涂抹在胚胎位置上方的卵表面上(對照組則吸取100 μL蒸餾水涂抹于龜卵表面)[28]。卵孵化過程中，每日檢查龜卵狀況，若發現龜卵表面出現霉菌斑塊或整枚卵霉變而不可孵，則及時清理霉斑或者移除霉變卵。

1.3 幼體大小、翻身表現及學習能力的測定

龜卵孵化后，記錄孵出的時間。孵化期以卵帶回實驗室至孵出為止的時間間隔表示，孵化成功率以各處理組成功孵出卵數占總入孵卵數的百分比表示。幼體孵出后，檢查畸形情況，用Mettler-Toledo電子天平測量體質量。

待孵出幼體腹部卵黃完全吸收后，測定其翻身表現。幼體翻身表現在溫度設置為29 ℃的人工氣候室中進行。測試開始前，將含有幼體的玻璃飼養缸(不含水)放置于人工氣候室1 h以使其體溫達到相應水平，并適應實驗室測試環境。待測的幼龜放置于小方盒(20 cm×10 cm×7 cm)中并迅速將其翻轉(背部朝下，腹部朝上)。方盒正上方架有垂直向下的Panasonic數碼攝像機(型號：HDC-HS900, Panasonic corporation, Osaka, Japan)同時記錄幼龜的翻身過程。翻身測試以10 min為限，若幼龜在該限期內未能成功翻身，則判定為翻身失敗。實驗結束后，視頻片段用MGI Video Wave III軟件(MGI Software Co., Canada)讀出，翻身時間以幼龜翻轉至翻身成功的時間間隔表示。

幼龜翻身表現測試結束后，單獨飼養于含水約3 cm高的飼養缸，并放置于29 ℃人工氣候室內。每隔3 d換水，待幼龜開食后，每日投喂適量商業化幼龜飼料。幼龜孵出約1個月后，測定其學習能力。幼龜學習能力測定在自制的玻璃十字迷宮中進行(圖1)[32]。十字迷宮內含高約3 cm的水，放置于29 ℃人工氣候室。學習能力測定前，幼龜禁食3 d。禁食結束后，幼龜移入十字迷宮內(A端)自行尋找食物2 d。將單只幼龜放入迷宮的一端，適量飼料放于其呈直角的一端(B端)。幼龜自由覓食，攝食后放回原飼養缸。之后2 d，在相同迷宮臂一端繼續投放食物，但于投放點前布以網孔的透明隔板使幼龜不能獲取食物。訓練結束后，撤掉投放點隔板，隨機選取幼龜移至訓練時一致的十字迷宮臂端。迷宮正上方架有垂直向下的Panasonic數碼攝像機以記錄整個測試期間的幼龜活動情況，視頻片段自動記錄于計算機。迷宮實驗限定時間為20 min，20 min內未找到食物則記為失敗。獲得的視頻片段用SMART視頻行為學分析系統(Vision 2.5, Panlab Inc., Barcelona, Spain)進行軌跡分析，記錄幼龜從放入迷宮至找到食物所用的時間和在迷宮內移動的總距離。

1.4 數據處理

200 mg·L-1處理組因實驗過程中操作失誤(卵被摔碰)使其中20枚卵不可孵，相應的數據并未用于后續統計分析。所有的數據用Statistica 6.0軟件包進行統計分析。在參數統計分析前，用Kolmogorov-Smirnov檢測驗證數據正態性；用Bartlett檢驗驗證數據方差同質性。用以入孵卵質量為協變量的單因子協方差分析檢測草甘膦銨鹽處理對孵出幼體大小的影響；用似然比檢驗(G檢驗)檢測不同處理下卵孵化成功率的差異；用單因子方差分析檢測草甘膦銨鹽處理對烏龜孵出幼體翻身表現和學習能力的影響；用Tukey檢驗進行多重比較。

圖1 烏龜學習行為測量的示意圖Fig. 1 The diagram of the apparatus used for learning behavioral measurement of turtles

2 結果(Results)

2.1 不同濃度草甘膦銨鹽處理對烏龜胚胎發育的影響

不同濃度草甘膦銨鹽處理組下孵入的烏龜卵大小(卵質量)無顯著差異(表1)。草甘膦處理對烏龜卵孵化成功率、孵化時間以及孵出幼體大小均無顯著影響(表1)。在各處理組孵出幼體中也未發現具明顯畸形的情況。

2.2 不同濃度草甘膦銨鹽處理對烏龜幼體翻身和空間學習能力的影響

幼體翻身測試中，僅少數個體未在實驗規定時間內完成翻身動作，相應個體的數據未用于后續統計分析。不同濃度草甘膦銨鹽處理對烏龜孵出幼體翻身表現的影響不顯著(F4, 105= 2.11,P= 0.085)(圖2)。迷宮實驗中，未完成覓食行為的相應個體數據也未用于后續的統計分析。不同濃度草甘膦銨鹽處理下孵出幼龜覓食時間存在顯著差異(F4, 65= 7.58,P< 0.001)(圖2)，200和2 000 mg·L-1濃度處理組孵出幼體的覓食時間顯著延長。高濃度的草甘膦銨鹽處理組的孵出幼體在迷宮中移動距離比低濃度處理組幼體更短，然而在統計上移動距離的組間差異是邊緣性的(F4, 65= 2.45,P= 0.055)(圖2)。

3 討論(Discussion)

胚胎發育期是動物整個生活史中最脆弱的階段，胚胎直接暴露于某些環境污染物可能影響個體后續發育階段的生長與功能表現。本研究用0～2 000 mg·L-1范圍內不同濃度的草甘膦銨鹽處理孵化中的烏龜卵，發現草甘膦銨鹽暴露不影響烏龜胚胎發育速率、孵出幼體大小，但潛在地影響其覓食表現，從而可能對其后期生長與存活產生負面效應。

草甘膦銨鹽暴露對烏龜卵孵化成功率、孵化時間和孵出幼體大小無顯著的影響。雖然草甘膦暴露對水生生物遺傳、生理和行為等方面的影響廣泛，但總體上仍然認為草甘膦制劑的毒性屬于低毒。本研究表明，草甘膦銨鹽暴露未造成發育中的烏龜胚胎直接死亡也不改變其發育速率，這一結果是可以預見的。相似的結果也見于其他物種。例如，0～5 000 mg·L-1濃度范圍內的草甘膦銨鹽暴露對中華鱉卵孵化成功率、胚胎發育速率和孵出幼體大小無影響[28]；68～1 501 mg·L-1草甘膦處理對紅耳滑龜卵的孵化成功率和孵出幼體大小影響不大，僅在11 206 mg·L-1濃度處理下孵化成功率較低、孵出幼體較小[26]。相似地，龜鱉類動物胚胎期經歷另一些農藥低濃度暴露，也沒有影響胚胎發育速率和孵出幼體體型大小。例如，0.004～0.1 mg·L-1的溴氰菊酯暴露并不會對紅耳滑龜和烏龜孵出幼體大小和孵化時間產生影響[27]；0.0001～0.1 mg·L-1的阿特拉津暴露也不會對2種地圖龜(Graptemysouachitensis和G.pseudogeographica)孵出個體大小和孵化時間產生影響[30]。

在濃度0～2 000 mg·L-1范圍的草甘膦銨鹽暴露不會影響烏龜幼體的翻身能力。龜類的翻身能力通常直接或間接地反映個體健康情況。在某些情況下，它也被認為是與龜生存直接相關的特性[33-34]。那些翻身遲緩的龜類在自然環境中更容易被捕食，或者受干旱失水等威脅。龜類胚胎發育時所經歷的環境(如溫度、濕度等因素)都會對孵出幼體的翻身能力產生影響[35]。以往大部分研究發現，胚胎時期的污染物暴露對幼龜翻身能力(例如紅耳滑龜胚胎在68～11 206 mg·L-1的草甘膦中暴露)的影響較小[26]。僅少數研究表明，污染物暴露導致龜類翻身能力降低。例如，Meter等[25]發現無論是暴露于原油還是多環芳烴都對北美擬鱷龜幼體的翻身能力產生顯著影響。

表1 不同濃度草甘膦銨鹽處理下烏龜入孵卵質量、孵化時間及孵出幼體大小Table 1 Egg mass, incubation length and hatchling body mass of Mauremys reevesii under different concentration treatments of glyphosate-ammonium

圖2 不同濃度草甘膦銨鹽處理組烏龜幼體翻身時間、覓食時間及覓食距離注：柱上方的不同字母表示平均值差異顯著，Tukey’s test，a>b。Fig. 2 Righting time, foraging time and movement distance during foraging of Mauremys reevesii hatchlings from different concentration treatments of glyphosate-ammoniumNote: Different letters above the vertical bars denote significant differences, Tukey’s test, a>b.

尋找定位重要的環境資源，如食物、水和遮蔽處，對水生動物的生存至關重要。空間學習表現反映了動物在搜尋食物時能否快速準確地定位并找到食物的能力，亦可反映在逃避捕食者時能否及時有效地避開危險境地的能力[36]。本研究顯示，草甘膦銨鹽暴露潛在地影響烏龜幼體的空間學習能力，例如，較高濃度草甘膦銨鹽暴露下孵出幼體的覓食時間較長，在整個覓食過程中其移動距離似乎也較長。以往的研究發現，一些污染物暴露也會影響動物的空間學習能力。例如，硫丹、氟氯氰菊酯和新煙堿類等殺蟲劑會對意大利蜜蜂(Apismellifera)[37]、歐洲熊蜂(Bombusterrestris)[38]的空間學習能力造成潛在的影響。此外，重金屬鉛和殺蟲劑毒死蜱暴露對大鼠的空間識別能力造成影響[39-40]。動物的學習和記憶的能力與膽堿能神經系統密切相關[41]，污染物暴露可以通過影響膽堿能神經系統，進而對動物的學習和認知能力產生損傷。例如，草甘膦暴露抑制乙酰膽堿酶等的活性在一些動物(包括魚類和蛙類蝌蚪)中已得到證實[42-43]，但是否與此類動物學習能力相關還需進一步研究。此外，許多的研究已經證實了草甘膦的神經毒性。例如，草甘膦會引起神經元的變性[44]，降低前額皮質、中腦和紋狀體中的5-羥色胺和多巴胺水平，從而造成兩者代謝物的累積[45]。同樣的，在人類研究中發現長期暴露于草甘膦會容易患上帕金森癥[46]。

盡管本研究顯示，草甘膦銨鹽暴露并沒有給烏龜胚胎發育以及孵出幼體翻身能力帶來明顯的脅迫效應，但幼體的空間學習能力可能受到抑制，預示著更深層次(例如神經系統)的負面效應。此外，草甘膦銨鹽暴露后幼體覓食時間延長會使其在覓食過程中承擔相對較大的被捕食風險，從而增大其后續的生存成本。自然環境中烏龜卵被埋于堤岸邊土壤中孵化。施用過草甘膦制劑的農田，經數天時間降解，其土壤中草甘膦殘留量不高(通常<1.0 mg·L-1)。因此，自然環境中烏龜胚胎發育受土壤殘留草甘膦的毒害作用應不會達到本研究所檢測到的程度。