啶氧菌酯對斑馬魚的安全性評價及其生物富集行為研究

郭寶元，張洋，王松雪

1. 國家糧食和物質儲備局科學研究院，北京 100037 2. 中國科學院生態環境研究中心，中國科學院環境生物技術重點實驗室，北京 100085

啶氧菌酯，化學名為(E)-3-甲氧-2-[2-[6-(三氟甲基)-2-吡啶氧甲基]苯基]丙烯酸甲酯，英文名為picoxystrobin，CAS號為117428-22-5，結構式如圖1所示。熔點為75 ℃，水中溶解度為0.128 mg·L-1，LogKow(20 ℃)為4.48[1]。啶氧菌酯主要用于防治麥類的葉面病害如葉枯病、葉銹病、穎枯病、褐斑病和白粉病等，與其他甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑相比，其對小麥葉祜病、網斑病和云紋病有更好的效果[2-3]。啶氧菌酯最早由先正達公司于2001年在歐洲推出，隨后在全球得到廣泛應用。但在之后的研究中發現，啶氧菌酯對水生生物存在著比較大的毒性，同時，其代謝產物具有潛在的致癌性，因此給其應用前景帶來一層陰影。

圖1 啶氧菌酯結構式Fig. 1 The structure of picoxystrobin

農藥施用的目的是達到病蟲害的防治作用，而農藥施用后，只有少部分可到達靶標，大部分則進入土壤，同時即使達到靶標的農藥，也會通過雨水沖刷而進入土壤，后通過地表徑流，進入水體，從而危害到水生生物的安全[4]。因此，對于農藥安全評價的一個重要環節是考察其對水生動植物的安全性。同時，考慮到啶氧菌酯logKow為4.48，具有強疏水性，可能在水生生物體內存在累積作用，從而對水生生物造成更大危害，乃至通過食物鏈傳導到食物鏈的其他環節[5]。

國內啶氧菌酯的登記工作剛剛開始，至2018年，在國內已經有8家企業成功登記該農藥[1]。而對啶氧菌酯的研究，已經涉及到其合成工藝優化[6]、藥效評價[7]、殘留檢測方法[8-10]以及在水土界面的環境行為等方面，對于其環境安全評價的研究還比較少。因此，本文開展啶氧菌酯對生物斑馬魚的安全性和風險研究，并考察其在生物體內的生物累積效應，以評估啶氧菌酯施用后，對水生食物鏈的風險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與試劑

TSQ Quantum Access MAX液相色譜-質譜聯用儀購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；HZQ-C空氣浴振蕩器購自哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司；湘儀離心機1850購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Mettler Toledo pH計購自瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團；上海雷磁JPB-607A型溶解氧分析儀購自上海儀電科學儀器股份有限公司。

乙腈(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司(北京)；乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。95%啶氧菌酯原藥由農業部農藥鑒定所惠贈，啶氧菌酯標準品(99.5%)購自Sigma-Aldrich。涉及流動相、提取等過程的用水采用Millipore超純水設備制備。暴露用水為經曝氣的自來水。

1.2 分析方法

流動相為V(0.33%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=10∶90，流速0.2 mL·min-1；色譜柱型號Hypersil GOLD25002-102130 (100 mm×2.1 mm)，柱溫30 ℃，樣品室溫度20 ℃；進樣方式為自動進樣，進樣體積5 μL；保留時間為1.75 min；離子源類型為ESI-，離子源溫度350 ℃。

水樣前處理方式：5 mL樣品，用5 mL二氯甲烷漩渦振蕩3 min，重復提取一次，合并二氯甲烷。取5 mL二氯甲烷濃縮近干，用5 mL乙腈定容，超聲3 min，過0.22 μL有機濾膜，待測。

魚體樣品前處理方式：1 g魚體樣品研磨(濕重)，加20 mL乙腈，浸泡振蕩過夜，離心5 min，取上清液過膜，待測；如有濃度高的樣品，稀釋后進樣。

1.3 急性毒性試驗

取95%啶氧菌酯原藥0.3065 g，以適量二甲基亞砜作為助溶劑，以吐溫80為穩定劑，用去離子水溶解定容至100 mL，得3.00 g a.i.·L-1儲備液。用曝氣自來水稀釋得到濃度為0.0300、0.0390、0.0507、0.0658和0.0856 mg a.i.·L-1的5組試驗處理藥液，以曝氣自來水為空白對照，以與最高濃度中二甲基亞砜和吐溫80含量相同的溶液為溶劑對照，對照組和各處理組均只設1個重復。每個燒杯中裝有2 L藥液，分別放入10尾斑馬魚。試驗期間不曝氣、不喂食。分別于24、48、72和96 h觀察斑馬魚中毒癥狀和死亡情況。

分別在試驗開始后0和24 h更換試驗溶液之前從各處理組取100 mL的供試物溶液，于冰箱中保存，用于啶氧菌酯水體濃度檢測。

計算各濃度組在試驗開始后24、48、72和96 h試驗魚的累計死亡率。采用SPSS軟件的Probit法計算各時間點的半數致死濃度(LC50)及其95%置信區間。

1.4 斑馬魚生物富集

稱取1.4 g 95%啶氧菌酯原藥，用水定容于1 000 mL容量瓶中，得到濃度為1 330 mg·L-1的儲備液，過膜后濃度為204 mg·L-1。

經斑馬魚急性毒性試驗得到96 h-LC50為0.0509 mg·L-1。試驗溶液配制濃度分別為96 h-LC50的1/100和1/10，即0.0005和0.005 mg·L-1。

根據設定濃度，配制2 L試驗水，每種濃度各16缸，每缸放置5條斑馬魚，同時設置空白對照。每24 h更換藥液。

于0、24、48、96、144和192 h分別從各處理中取水樣與魚樣，測定水樣與魚樣中的供試物含量。

檢測試驗過程中魚體內啶氧菌酯濃度，啶氧菌酯的生物富集系數按公式(1)計算：

(1)

式中：BCF為生物富集系數(bioconcentration factor)；Cfs為魚體內的啶氧菌酯含量(mg·kg-1)；Cws為水體中的啶氧菌酯含量(mg·L-1)。

2 結果(Results)

2.1 LC-MS/MS分析方法

使用LC-MS/MS測定樣品，其線性范圍為0.001～1.5 mg·L-1，標準曲線回歸方程為Y= 37739475398x+509582745，R2= 0.9920；色譜圖中，在啶氧菌酯出峰的位置沒有干擾峰；在水中加入啶氧菌酯原藥儲備液，使其濃度為1.0和0.001 mg·L-12個濃度，平均添加回收率為88.99%～105.10%，相對標準偏差(RSD)為4.83%～5.5%，最低檢測濃度為0.001 mg·L-1；在魚體中加入啶氧菌酯原藥儲備液，使其濃度為0.004和5.2 mg·kg-12個濃度，平均添加回收率為72.07%～108.16%，RSD為2.53%～7.44%，最低檢測濃度為0.004 mg·kg-1；該方法能夠滿足水中/魚體啶氧菌酯的測定的要求。

2.2 啶氧菌酯對斑馬魚的急性毒性

試驗期間pH值范圍為7.6～8.1，水溫范圍為23.0～25.0 ℃，溶解氧在65%～77%范圍內，符合試驗要求。啶氧菌酯的設定濃度為0.300、0.390、0.507、0.658和0.856 mg a.i.·L-1，0、24 h后對應的試驗用水中啶氧菌酯濃度降低1.58%～6.75%，啶氧菌酯濃度均大于設定濃度的80%。試驗期間空白對照試驗用魚并未出現異常情況。各啶氧菌酯處理組斑馬魚均表現出興奮，尤其高濃度處理組的斑馬魚，隨著時間的延長，魚開始游動失衡，魚體側翻，游速緩慢，反應遲鈍，嚴重的出現死亡。

表1 95%啶氧菌酯原藥對斑馬魚(Brachydonio rerio)急性毒性試驗結果Table 1 Acute toxicity test results of 95%picoxystrobin in Brachydonio rerio

依據表1的實驗結果，計算啶氧菌酯對斑馬魚的急性毒性，96 h-LC50為0.0509 mg a.i.·L-1，95%置信區間為0.0314～0.0641 mg a.i.·L-1。根據國家標準《化學農藥環境安全評價試驗準則》中對魚類的毒性等級劃分標準，95%啶氧菌酯對斑馬魚急性毒性指標96 h-LC50<0.1 mg a.i.·L-1，屬“劇毒”級。

2.3 啶氧菌酯在斑馬魚體內的生物累積效應

啶氧菌酯對斑馬魚的毒性屬劇毒，而它同時還可能存在著生物累積效應，因此，啶氧菌酯對斑馬魚等水生生物形成更大安全風險。根據LC50設置啶氧菌酯的生物富集試驗濃度，采用1/10和1/100 LC50啶氧菌酯進行生物富集的試驗，結果如圖2所示。結果表明，啶氧菌酯在斑馬魚體內存在明顯的生物富集效應。從暴露開始，啶氧菌酯在斑馬魚體內有一個快速累積的過程，在0.005 mg·L-1(1/100 LC50)水平下暴露24 h后，斑馬魚體內的啶氧菌酯的濃度就達到0.037 mg·kg-1，BCF24 h達到61.67，隨后，斑馬魚體內的啶氧菌酯增加速度變得緩慢。到第2天(48 h)時，斑馬魚體內的啶氧菌酯濃度基本達到平衡，BCF達到73.33，到第8天(192 h)時，斑馬魚體內的濃度達到0.048 mg·kg-1，BCF8 d緩慢增長到80.00。

在更高濃度的暴露環境中，在1/10 LC50(0.005 mg·L-1)水中，24 h后，斑馬魚體內啶氧菌酯濃度就達到平衡，約為0.553 mg·kg-1，BCF24h基本達到106.35。隨后斑馬魚體內的啶氧菌酯濃度維持平衡，生物富集因子也小幅波動，到192 h后，斑馬魚體內的啶氧菌酯濃度為0.527 mg·kg-1，BCF8 d值為99.42。

農藥等化學品的生物富集性，一般認為是與其Kow相關。通常Kow越大，生物累積性越高，如蒽的logKow= 4.45，其在斑馬魚體內的生物累積大約是2.48×104～6.14×104 [11-13]。啶氧菌酯的logKow=4.48，雖然與蒽接近，但其在斑馬魚體內的富集效應在80.00～99.43之間，相差達2～3個數量級。此結果表明，一方面，啶氧菌酯可以在生物體內富集；另外一方面，其在生物體內存在代謝過程，使其在富集平衡時，生物富集因子遠遠低于多環芳烴的富集因子。

3 討論(Discussion)

根據《化學農藥環境安全評價試驗準則》，啶氧菌酯對斑馬魚有劇毒。啶氧菌酯在水體中水解緩慢，而在生物體內也具有比較高的穩定性，同時，其疏水性強，在生物體內的降解速度比累積速度慢，容易在生物體內累積。經過8 d暴露，在低濃度下，生物富集因子可以達到80.00，而在比較高的環境濃度下，生物富集因子也可以達到99.42。根據GB/T 31270.7—2014《化學農藥環境安全評價試驗準則 第7部分：生物富集試驗》中農藥生物富集性評價標準，在10

圖2 斑馬魚體內啶氧菌酯富集系數(BCF)的變化規律Fig. 2 Variation of picoxystrobin bioconcentration factor (BCF) in Brachydanio rerio