丙硫菌唑對斑馬魚的安全性評價及其生物富集行為研究

郭寶元，張洋，王松雪

1. 國家糧食和物質儲備局科學研究院，北京 100037 2. 中國科學院生態環境研究中心，中國科學院環境生物技術重點實驗室，北京 100085

丙硫菌唑，化學名為2-(2-(1-氯環丙基)-3-(2-氯苯基)-2-羥丙基)-1-2-二氫-3-1,2,4-三唑-3-硫酮，英文名prothioconazole，CAS號178928-70-6，結構式如圖1所示。熔點139.1～144.5 ℃，Henry常數<3×10-5Pa·m3·mol-1，飽和蒸氣壓(20 ℃)<4×10-7Pa，LogKow(20 ℃)為4.05，水中溶解度(20 ℃，pH=7)為0.3 g·L-1[1-2]。丙硫菌唑是一種廣譜三唑類殺菌劑，主要防治由子囊菌、擔子菌和半知菌等3類致病菌引起的病害，用于防治禾谷類作物小麥、大麥和水稻等的多種病害，同時對油菜、花生、豆類、黃瓜和番茄等的眾多病害防治效果也非常好[3-5]。自2004年首獲登記以來已在全球60多個國家登記并銷售，在殺菌劑中就占據了重要地位。2015年，全球擁有5.00億美元以上銷售額的殺菌劑只有8個，丙硫菌唑以8.00億美元的銷售額位居第三。雖然國內目前登記工作剛剛開始，根據中國農藥信息網公布的數據，迄今為止，僅海利爾和久易農業2家企業完成原藥登記，海利爾、久易農業和溧陽中南化工3家企業進行了3種制劑登記，綜合來看，丙硫菌唑在國內市場應該是一種非常有前景的殺菌劑[1-2]。

圖1 丙硫菌唑結構式Fig. 1 The structural of prothioconazole

一般來說，農藥在施用后，只有少部分能夠到達其靶標，大部分會落入土壤，同時滯留在植株上的農藥也會通過雨水沖刷而進入土壤，然后通過地表徑流，進入水體，從而危害水生生物的安全[6]。因此，對于農藥的安全評價需要考察其對水生動植物的安全性。同時，考慮到丙硫菌唑的logKow為4.05，具有比較高的疏水性，其在水生生物體內的累積作用也是不可忽視的[1]。國內丙硫菌唑的登記工作剛剛開始，目前，丙硫菌唑的研究還多集中于合成工藝優化[7-9]、藥效評價[3-5]與殘留方法[10-11]等方面，對于其環境安全評價研究還比較少。筆者近來發現了丙硫菌唑在生物體內代謝和累積規律[12]，以此為基礎，本文開展了丙硫菌唑對斑馬魚的安全性評價及其在魚體內的生物累積效應，以評估丙硫菌唑施用后，對水生生物的風險。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

TSQ Quantum Access MAX液相色譜-質譜聯用儀(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；湘儀離心機1850(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司)；HZQ-C空氣浴振蕩器(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司)。Mettler Toledo pH計(梅特勒-托利多國際有限公司)；上海雷磁JPB-607A型溶解氧分析儀(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

二氯甲烷(分析純)和乙腈(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司(北京)；乙腈(色譜純)和甲酸(色譜純)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。95%丙硫菌唑原藥和50%丙硫菌唑水分散粒劑由農業部農藥鑒定所惠贈，丙硫菌唑標準品(99.5%)購自Sigma-Aldrich。涉及流動相、提取等試驗步驟的用水采用Millipore超純水設備制備。暴露用水為經過曝氣的自來水。

暴露試驗用水：試驗用水為存放并去氯處理24 h以上的自來水。水質硬度在10～250 mg·L-1之間(以CaCO3計)，水溫控制在20～25 ℃，pH在6.0～8.5之間，并且試驗期間pH變化量在±0.5之間，溶解氧保持在試驗溫度下飽和值的60%。

供試魚：試驗用魚為斑馬魚(Brachydaniorerio)，試驗用斑馬魚為實驗室繁育。選取健康無病、大小一致的斑馬魚為試驗對象。試驗前在與試驗時相同的環境條件下馴養7 d，馴養期間每天喂食0.02 g，每日光照12 h，及時清除糞便及食物殘渣。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜質譜分析方法

液相色譜質譜(High Performance Liquid Chromatograph Mass Spectrometer, HPLC-MS)條件如下：流動相為V(0.33%甲酸水溶液)∶V(乙腈)=10∶90，流速為0.2 mL·min-1，色譜柱型號為Hypersil GOLD25002-102130 (100 mm×2.1 mm)，柱溫為30 ℃，樣品室溫度為20 ℃，進樣方式為自動進樣，進樣體積為5 μL，保留時間為1.75 min，離子源類型為ESI-，離子源溫度為350 ℃。

水樣前處理方式：5 mL樣品，用5 mL二氯甲烷漩渦振蕩3 min，重復提取一次，合并二氯甲烷。取5 mL二氯甲烷濃縮近干，用5 mL乙腈定容，超聲3 min，過0.22 μL有機濾膜，待測。

魚體前處理方式：1 g斑馬魚(濕重)研磨，加20 mL乙腈，浸泡振蕩過夜，離心5 min，取上清液過膜，待測，濃度高的，稀釋后進樣。

1.2.2 急性毒性試驗

急性毒性試驗方法參考《化學農藥環境安全評價試驗準則 第12部分：魚類急性毒性試驗》(GB/T 31270.12—2014)。取50%丙硫菌唑水分散粒劑2.0011、4.0019 g，用曝氣自來水分別溶解定容至1 000、2 000 mL，混合后得到理論濃度為1.00 g a.i.·L-1儲備液，使用0.45 μm濾膜過濾后得到溶液濃度為41.2 mg a.i.·L-1。空白中不添加農藥成分，其他保持一致。

用曝氣水將儲備液稀釋為1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-15個濃度組。溶液配制如表1所示。

試驗各濃度組均不設重復，在每個燒杯中加入2 L供試藥液或試驗用水后，分別放入10尾試驗魚。試驗周期為96 h，每隔24 h更換原有藥液。分別在試驗開始后0、24、48和72 h及試驗結束時，測定并記錄試液的溫度、pH值和溶解氧含量。并在試驗開始后6、24、48和72 h及試驗結束時，觀察并記錄試驗魚的中毒癥狀和死亡數目。

分別在試驗開始后0和24 h更換試驗溶液之前從各處理組取100 mL的供試物溶液，于冰箱中保存，用于丙硫菌唑水體濃度檢測。

計算各濃度組在試驗開始后24、48、72和96 h試驗魚的累計死亡率。采用SPSS軟件的Probit法計算各時間點的半數致死濃度LC50及其95%置信區間。

1.2.3 斑馬魚生物富集

生物富集試驗參考國家標準《化學農藥環境安全評價試驗準則 第7部分：生物富集試驗》(GB/T 31270.7—2014)。稱取1.4 g 95%丙硫菌唑原藥，用水定容至1 000 mL，得到濃度為1 330 mg·L-1的儲備液，過膜后濃度為204 mg·L-1。

斑馬魚急性毒性試驗結果顯示，96 h-LC50為2.0 mg·L-1。試驗溶液配制濃度分別為96 h-LC50的1/100和1/10，即0.02和0.2 mg·L-1。

根據設定濃度，配制2 L試驗水，每種濃度各16缸，每缸放置5條斑馬魚，同時設置空白。每24 h更換藥液。

于0、24、48、96、144和192 h分別從各處理中取水樣與魚樣，測定水樣與魚樣中的供試物含量。

檢測魚體攝入丙硫菌唑的實際值。魚體對丙硫菌唑的富集系數按公式(1)計算[12-16]。

(1)

式中：BCF為生物富集系數(bioconcentration factor)；Cfs為魚體內的供試物含量(mg·kg-1)；Cws為水體中的供試物含量(mg·L-1)。

表1 50%丙硫菌唑水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗結果Table 1 Acute toxicity test results of 50% prothioconazole in Brachydonio rerio

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 LC-MS/MS分析方法

樣品測定的LC-MS/MS分析方法中，線性范圍為0.002～1.0 mg·L-1，標準曲線回歸方程為Y= 294910x+13626，R2= 0.9931；色譜圖中，在丙硫菌唑出峰的位置沒有干擾峰；在水中加入丙硫菌唑原藥儲備液，使其濃度為0.08和1.0 mg·L-12個濃度，平均添加回收率為96.71%和90.64%，相對標準偏差(RSD)為3.56%和2.54%；在魚體中加入丙硫菌唑原藥儲備液，使其濃度為0.05和10.0 mg·kg-12個濃度，平均添加回收率為85.83%和91.35%，RSD為3.66%和3.16%。方法以3倍信噪比計算的話，檢測限(LOD)<0.002 mg·L-1的定量限(LOQ)時，以實際添加回收濃度為準，水中為0.08 mg·L-1，魚中為0.05 mg·kg-1。該方法能夠滿足水中/魚體中丙硫菌唑的測定要求。

2.2 丙硫菌唑對斑馬魚的急性毒性

試驗期間pH值為7.6～8.1，水溫為22.5～23.1 ℃，溶解氧為67%～77%，符合試驗要求。試驗期間空白對照試驗用魚并未出現異常情況。在試驗開始后6 h，設定濃度為1.50、1.81和2.16 mg a.i.·L-1的處理組中試驗魚在燒杯底部集群游動；設定濃度為2.60、3.11 mg a.i.·L-1的處理組試驗魚反應激烈，有竄游、側翻及失去平衡現象。試驗結束后，所有5個設定濃度1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-1處理組均出現試驗用魚游動能力下降、躺于容器底部和死亡癥狀。

丙硫菌唑的設定濃度為1.50、1.81、2.16、2.60和3.11 mg a.i.·L-1，0、24 h后對應的試驗用水中供試物含量均大于設定濃度的80%。

依據表1的實驗結果，計算丙硫菌唑對斑馬魚的急性毒性，結果如表2所示。

大部分三唑類對大多數非靶標生物毒性比較低[17]，對魚類表現出中等毒性[18-19]。根據國家標準《化學農藥環境安全評價試驗準則》中對魚類毒性等級的劃分標準，50%丙硫菌唑水分散粒劑對斑馬魚急性毒性指標96 h-LC50在1.00～10.0 mg a.i.·L-1范圍內，屬“中毒”級。

2.3 丙硫菌唑在斑馬魚體內的生物累積效應

根據丙硫菌唑的LC50設置丙硫菌唑在斑馬魚體內的富集試驗濃度，采用1/10和1/100 LC50進行生物富集的試驗，結果如圖2所示。依據試驗結果，丙硫菌唑在斑馬魚體內存在生物富集效應。從暴露開始，丙硫菌唑在斑馬魚體內快速累積，在0.02 mg·kg-1(1/100 LC50)水平下暴露24 h后，斑馬魚體內的丙硫菌唑的濃度達到0.302 mg·kg-1，BCF24 h為15。隨后，斑馬魚體內的丙硫菌唑逐步增加。4 d(96 h)時，斑馬魚體內的丙硫菌唑濃度基本達到平衡，BCF達到30.34；到192 h(8 d)時，斑馬魚體內的濃度達到0.733 mg·kg-1，BCF8 d緩慢增長到34.36。

圖2 丙硫菌唑富集系數(BCF)與暴露濃度和暴露時間的關系圖注：1/100和1/10 LC50的濃度為0.02、0.2 mg·kg-1。Fig. 2 Variation of bioconcentration factor (BCF) of prothioconazole vs exposure time in Brachydanio rerio at different treatment concentrationsNote: 1/100 and 1/10 LC50 of the prothioconazole concentrations are 0.02 and 0.2 mg·kg-1.

表2 50%丙硫菌唑水分散粒劑對斑馬魚急性毒性試驗的LC50Table 2 Acute toxicity test results (LC50) of 50% prothioconazole in Brachydonio rerio

在1/10 LC50(0.2 mg·L-1)水中，24 h后，斑馬魚體內的丙硫菌唑的濃度就達到0.302 mg·kg-1，BCF24 h為16.69，與1/100 LC50相當水平。而經過24 h暴露后，斑馬魚體內的丙硫菌唑濃度基本達到平衡。隨后斑馬魚體內的丙硫菌唑濃度緩慢增加，生物富集因子也小幅增長，到192 h時，斑馬魚體內的丙硫菌唑濃度為4.198 mg·kg-1，BCF8 d值為19.72。

大部分三唑類農藥包括丙硫菌唑在水體中水解緩慢，而在生物體內也具有比較高的穩定性，同時，它疏水性強，在生物體內的降解速度比累積速度慢，容易在生物體內累積[14-16]。經過8 d暴露，在低濃度下，生物富集因子可以達到35.36，而在比較高的環境濃度下，生物富集因子也可以達到19.72。根據《化學農藥環境安全評價試驗準則 第7部分：生物富集試驗》(GB/T 31270.7—2014)中農藥生物富集性評價標準(如表2所示)在10

丙硫菌唑對斑馬魚有一定的毒性，毒性等級為中毒，同時，在斑馬魚體內還存在生物累積效應，累積效應為中等富集性。因此，丙硫菌唑的風險，可能會通過食物鏈放大。在丙硫菌唑的推廣和使用的過程中，應該考慮到其潛在的環境風險。