短、中、長鏈氯化石蠟暴露對細胞代謝影響的比較研究

任曉倩，張海軍，耿檸波，王菲迪，張保琴，羅云，陳吉平,*

1. 中國科學院大連化學物理研究所，中國科學院分離分析化學重點實驗室，大連 116023 2. 中國科學院大學，北京 100049 3. 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，省部共建國家重點實驗室培育基地—浙江省植物有害生物防控重點實驗室，杭州 310021

氯化石蠟(chlorinated paraffins, CPs)是一類人工合成的氯代正構烷烴，根據其碳鏈長度的不同，可分為短鏈(SCCPs, C10-13)、中鏈(MCCPs, C14-17)和長鏈(LCCPs, C18-30)氯化石蠟[1]。由于具有良好的化學穩定性，氯化石蠟被廣泛用作塑料和橡膠的阻燃劑和增塑劑、皮革柔順劑、紡織物整理劑和金屬加工過程的切削液等，在生產和使用過程中不斷向環境釋放[2]。

在氯化石蠟產品中，SCCPs已被證實具有遠距離環境遷移能力、環境持久性、生物累積性和較高毒性[3]。2017年5月，SCCPs被列入《關于持久性有機污染物的斯德哥爾摩公約》附錄A的受控清單[4]，單獨的SCCPs產品生產被要求停止。聯合國環境署的SCCPs風險管理評估報告中，推薦考慮MCCPs和LCCPs作為SCCPs的代替物，其可行性仍有待進一步評估[5]。中國是世界上最大的CPs生產國和使用國，生產企業高達150余家，產能超過100萬t[6-7]。氯化石蠟普遍存在于環境介質和生物體中，并在人體內富集[8]。初步調查結果表明，SCCPs在中國人體血液和母乳中的含量分別為14～3 500 μg·L-1和5.24～644 μg·L-1；MCCPs在中國人體血液和母乳中的含量分別為6.3～320 μg·L-1和0.89～60 μg·L-1；LCCPs在中國人體血液中的含量為1.0～21 μg·L-1[9-10]。

已有的毒理學研究表明，SCCPs對嚙齒類動物具有肝毒性[11]、腎毒性[12]和甲狀腺毒性[13]，長期暴露具有致癌性[14]，并且具有內分泌干擾效應[11,15-17]。然而，關于MCCPs和LCCPs的毒性研究相對較少。由于MCCPs具有與SCCPs相似的結構特點，根據“化學品注冊、評估、許可和限制”法規原則，二者均被歐盟列入內分泌干擾物候選清單[6]。研究單次飼喂MCCPs對Wistar大鼠的毒性效應時發現，MCCPs(C14-17, 51%～60% Cl)會導致大鼠產生豎毛、昏睡和尿失禁的行為現象[18]。研究發現，MCCPs(C14-17, 40% Cl)會引起大鼠和小鼠的肝細胞腫大、過氧化物酶體增殖以及肝細胞平滑內質網增殖[18]。此外，Bucher等[14]發現，LCCPs能夠使小鼠產生肉芽腫性炎癥效應。短、中和長鏈氯化石蠟可能具有顯著的毒性效應差別，目前尚缺乏相應的比較研究。

代謝組位于基因組、轉錄組和蛋白質組下游，污染物在不同層面的毒性效應可以靈敏地反映在代謝組的變化上；同時，代謝組的變化能為毒性作用機制和生物表型狀態之間的關系提供一個深入觀察的視角[19]。本研究以人肝癌細胞HepG2為受試細胞，借助代謝組學研究方法，探討了在同一劑量水平下短、中和長鏈氯化石蠟暴露對細胞小分子代謝物的干擾，從代謝組層面揭示三者毒性效應的異同。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

3種氯含量相近的氯化石蠟標準品，包括SCCPs(51.5% Cl)、MCCPs(52% Cl)和LCCPs(49% Cl)標準品購于德國Labor Dr. Ehrenstorfer-Sch?fers公司，質量濃度均為100 mg·L-1，溶于環己烷。細胞培養基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶(0.25% Trypsin-EDTA)購自美國Gibco公司，青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS)購于Hyclone公司(Logan, UT)。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、ACS級二甲基亞砜(DMSO)購自美國AMRESCO公司(Amresco, Solon, OH, USA)，純度>98%；質譜純乙腈和甲醇購自德國Merck公司，色譜級甲酸購自日本TCI公司，色譜級碳酸氫銨購自中國百靈威公司。1-十二烷基溶血卵磷酯(LPC 12:0)和1-月桂酰-2-羥基-sn-甘油酸-3-卵磷脂1,2-二十七烷酰-sn-甘油酸-3-磷酸乙醇胺(PE 17:0)購自美國AVANTI公司，D5-L-苯丙氨酸和(D3-8,8,8)-L-辛?；鈮A購自美國Sigma-Aldrich公司，十一烷酸(FFA C11:0)和十九烷酸(FFA C19:0)購自阿拉丁試劑公司。實驗用水為Milli-Q超純水(Millipore, Billerica, MA, USA)。

1.2 儀器設備

二氧化碳培養箱(BB16UV/BB5060UV，Heraeus，德國)；全能臺式高速冷凍離心機(Biofuge?Stratos，Heraeus，德國)；超聲細胞破碎儀(SCIENTZ JY 96-IIN，寧波新芝)；超低溫冰箱(NUAIRE NU-6382E，美國)；倒置顯微鏡(XD-101型，南京江南光電股份有限公司)；微板振蕩器(LAB-LINE 4625-1，美國)，冷凍干燥機(Genesis 25&35，美國)；渦旋振蕩儀(Scientific Industries G-560E，美國)；酶標儀(Tecan Infinite F50，瑞士)；液相色譜(Waters Acquity UPLC，美國)/串聯四極桿線性離子阱質譜儀(AB SCIEX Q-Trap 5500，美國)；液相色譜(Agilent 1290 UPLC，美國)/串聯高分辨率飛行時間質譜儀(Agilent 6540，美國)。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞培養與暴露

人肝癌細胞HepG2在37 ℃、5% CO2的條件下培養，培養基為含有10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的DMEM完全培養基。將對數期生長的細胞接種在96孔板，用于細胞增殖活性測試，接種密度為4×104細胞/孔，待細胞鋪滿96孔板的80%后進行CPs暴露試驗。將對數期生長的細胞接種在6孔板內，用于代謝干擾試驗研究，接種密度為3×105細胞/孔，待細胞鋪滿6孔板的80%后進行暴露試驗，暴露時間為24 h。3個氯化石蠟暴露組的暴露劑量均為100 μg·L-1，這一濃度與氯化石蠟在人體血液中的含量水平相當[9]。氯化石蠟分別溶解在DMSO中引入細胞培養液，DMSO在培養液中的終濃度為0.05%(V/V)，空白對照組僅包含0.05%的DMSO。對照組和3個暴露組均設置6個平行。

1.3.2 細胞活力檢測

細胞活力采用MTT法檢測。暴露試驗結束后，每孔加入20 μL MTT液(5 mg·mL-1，溶于PBS緩沖溶液)，繼續在37 ℃、5% CO2培養箱中培養4 h。然后吸出孔內培養液，每孔加入150 μL DMSO，溶解活細胞與MTT結合形成的紫色晶體。室溫下，將96孔板置于微孔板振蕩器上震蕩10 min，使結晶物溶解，采用酶標儀在492 nm波長下檢測各孔吸光度值。

1.3.3 小分子代謝物提取

采用細胞培養液分析代謝組的變化。細胞培養液中小分子代謝物與細胞內小分子代謝物具有平衡關系，因此，分析細胞培養液中代謝物的變化可反映細胞內的代謝變化。并且，細胞培養液中小分子代謝物的分析具有基質干擾小和靈敏度高的優點。細胞暴露24 h后，移取1 mL細胞培養液至離心管中，冷凍干燥。加入500 μL包含6個內標的提取液(80%甲醇/水，V/V)，渦旋提取30 min，在13 000×g、8 ℃下，高速離心20 min，然后取上清液過0.22 μm有機濾膜，并轉移到vail管中保存，待儀器分析。

1.3.4 小分子代謝物儀器分析

采用擬靶向代謝組學方法對胞外小分子代謝物進行分析，該方法具有較好的重現性與較寬的線性范圍[20]。首先采用高分辨UPLC-Q-TOF MS的Auto MS/MS對分子量在50～1 000的代謝物進行全掃描和二級質譜掃描，以獲得離子對信息。然后，采用高靈敏度的UPLC-Q-Trap MS對獲得的離子對進行Schedule MRM分析，離子化方式為電噴霧電離(ESI)，掃描模式為正負離子分別掃描。

正離子模式采用的色譜柱為Acquity UPLC BEH C8柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國)，柱溫50 ℃，進樣量10 μL，流速350 μL·min-1；流動相A為0.1%的甲酸水溶液(V/V)，B為0.1%的甲酸乙腈(V/V)。流動相梯度為：初始流動相為10% B；3 min時上升到40% B；15 min時再上升到100% B，并保持5 min；20.1 min時回到10% B，平衡2.9 min。負離子模式采用的色譜柱為Acquity UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters，美國)，柱溫50 ℃，進樣量10 μL，流速350 μL·min-1；流動相A為5 mmol·L-1碳酸氫銨的水溶液，B為5 mmol·L-1碳酸氫銨的甲醇溶液。流動相梯度為：初始流動相為2% B，保持1 min；3 min時上升到42% B；12 min時再上升到100% B，并保持4 min；16.1 min時回到2% B，平衡3.9 min。

1.4 數據處理及統計分析

Q-TOF采集的數據用Agilent MassHunter Qualitative Analysis B.04.00軟件進行處理。Q-Trap得到的數據用AB SCIEX的MultiQuant 3.0.1軟件進行峰識別和匹配，去掉缺失值后，導出ESI+和ESI-模式下經內標校正過的峰面積數據，合并為一個數據表進行歸一化處理，以校正培養液質量造成的差異。利用SIMCA-P 11.0軟件(Umetrics, Sweden)對數據進行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，用以觀察實驗的穩定性和樣品分型；使用SPSS PASW軟件進行單因素方差分析(ANOVA)和t-test，用以判斷代謝物在對照組和暴露組之間是否存在顯著性差異。聯合變量重要性因子值(variable importance in the projection, VIP)>1，且P<0.05被認為是顯著差異代謝物?；贙EGG數據庫，采用IncroMap軟件(version 1.7.0)對差異代謝物進行通路富集分析。

1.5 質量控制與質量保證(QA/QC)

為確保代謝分析方法的穩定性與重現性，所有樣本的混合樣用作質量控制(QC)樣品插入分析序列。首先分析2次QC樣品，接著每隔6個待測樣品后插入一個QC樣品，共分析7次QC樣品。正離子模式下共檢測到313個色譜峰，其中61.0%色譜峰豐度的相對標準偏差(RSD)<10%，93.6%色譜峰豐度的RSD<20%。負離子模式下共檢測到157個色譜峰，67.5%色譜峰豐度的RSD<10%，92.4%色譜峰豐度的RSD<20%。此外，PCA結果表明，所有QC樣品的因子得分在第一主成分方向均落在2倍標準偏差的置信區間內。這些結果表明，代謝物擬靶向分析序列具有較好的穩定性和重現性，所得數據穩定可靠，滿足定量分析的要求。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 CPs暴露對HepG2細胞增殖活性的影響

如圖1所示，與對照組相比，短、中和長鏈氯化石蠟均顯著降低了HepG2細胞的增殖活性，細胞平均活力分別降低了11.7%、8.8%和10.6%；但3個氯化石蠟暴露組的細胞活力沒有顯著差異。這一結果表明，氯含量相當的SCCPs、MCCPs和LCCPs誘導的細胞毒性相近。

2.2 多變量模式識別分析與差異代謝物鑒定

擬靶向分析共檢測到470種代謝物，采用PLS-DA對短、中和長鏈氯化石蠟暴露組和對照組的代謝物豐度數據進行統計分析。結果表明，表示模型解釋能力的參數R2=0.89，表示模型預測能力的參數Q2=0.74，證明PLS-DA結果可靠，不存在過度擬合現象。由PLS-DA得分圖(圖2(a))可見，在第一主成分方向上，3個氯化石蠟暴露組均能與對照組明顯分開，表明氯化石蠟引起了細胞代謝活動的紊亂。其中，SCCPs與LCCPs在2個主成分方向都能明顯分開，表明二者對細胞代謝的影響存在顯著差別；而MCCPs與SCCPs和LCCPs在2個主成分方向均不能明顯分開，表明MCCPs對細胞代謝的干擾效應與二者皆有相似之處。通過計算代謝擾亂水平指數(MELI)，比較了不同碳鏈長度氯化石蠟暴露對細胞總體代謝的干擾強度。如圖2(b)所示，3個氯化石蠟暴露組的MELI值與對照組相比都明顯升高，但3個暴露組的MELI值沒有顯著差異。SCCPs的平均MELI值略高于MCCPs和LCCPs的平均MELI值，表明SCCPs對細胞總代謝的干擾程度略高。

圖1 短、中和長鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞增殖活性的影響注：Control表示對照組；SCCPs、MCCPs和LCCPs表示短、中和長鏈氯化石蠟，暴露濃度為100 μg·L-1，暴露時長為24 h；**表示與對照組相比顯著性差別在0.01水平。Fig. 1 Effects of exposure to short-chain chlorinated paraffins (SCCPs), medium-chain chlorinated paraffins (MCCPs) and long-chain chlorinated paraffins (LCCPs) on the viability of HepG2 cellsNote: Exposure concentrations is 100 μg·L-1; exposure duration is 24 h; ** indicate the significant differences at 0.01 level in comparison to the control.

首先，利用Q-TOF高分辨率的優點，根據精確分子量及同位素分布在Agilent代謝物質譜數據庫(Metlin)中對檢測到的470種代謝物進行初步定性，結合化合物二級質譜圖信息在數據庫中對比確定代謝物化學結構。進一步通過搜索網絡數據庫Human Metabolome Database、KEGG和Metlin對定性結果進行驗證[21]。經過上述步驟后，共定性鑒定出195種代謝物。通過ANOVA分析，共找出94種差異且定性的代謝物(P<0.05，FDR<0.05且VIP>1)。

差異代謝物包括：12種氨基酸(AAs)、10種脂肪酸(FFAs)、8種肉堿、14種磷脂酰膽堿(PCs)、10種溶血磷脂酰膽堿(LysoPCs)、1種磷脂酰乙醇胺(PE)、2種溶血磷脂酰乙醇胺(LysoPEs)、8種鞘磷脂(SMs)、1種溶血鞘磷脂(LysoSM)、6種三羧酸循環相關代謝物、3種嘌呤、2種嘧啶和17種其他代謝物。與對照組相比，PCs、LysoPCs、SMs、鳥氨酸、蘇氨酸和谷氨酸在3個暴露組中均呈現顯著下降趨勢。FFAs、LysoPEs、肉堿、三羧酸循環相關代謝物和大部分AAs在3個暴露組中均呈現上升趨勢。

2.3 代謝通路富集分析

采用IncroMap軟件對94種差異代謝物進行通路富集分析。基于KEGG通路數據庫找出受顯著影響的代謝通路，從中選出P<0.05并且與肝代謝有關的通路。通路富集分析得到的Q值可反映代謝通路的受影響程度，根據Q值對這些通路進行了分類，結果如圖3所示。3個暴露組中，共有14條代謝通路受到顯著影響，3組之間既有相似性又有差異性。短、中和長鏈氯化石蠟對5條脂類代謝通路擾亂最為劇烈，且三者影響程度相近，包括甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝和鞘磷脂代謝。3個暴露組均影響了3條氨基酸代謝通路，分別是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成，?；撬岷蛠喤；撬岽x；除此之外，LCCPs還擾亂了苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路。相比于SCCPs和MCCPs，LCCPs對氨基酸代謝表現出了更強的干擾效應。

圖3 基于代謝通路富集分析獲得的短、中和長鏈氯化石蠟暴露顯著干擾的代謝通路Fig. 3 The most relevant metabolic pathways perturbed by SCCPs, MCCPs and LCCPs exposure based on pathway enrichment analysis

2.4 對磷脂代謝的影響

磷脂不僅是細胞膜和各種細胞器(線粒體、內質網和細胞核等)膜的重要組成成分，還參與調節生物體內的許多重要功能，如神經傳導、降血脂和降低膽固醇等[22]。由代謝通路富集分析結果可知，氯化石蠟暴露對磷脂代謝的影響最為顯著。如圖4所示，在甘油磷脂代謝通路中，3種氯化石蠟均引起了細胞內膜主要組成成分PCs及其水解產物LysoPCs的同步下調，LysoPCs的代謝物甘油磷脂膽堿(GP-C)和膽堿的含量也表現出顯著下調趨勢，表明PCs和LPCs的代謝降解被加強。此外，細胞外膜的主要組成成分SMs及其水解產物LysoSM的水平在3個氯化石蠟暴露組中均呈現顯著降低趨勢，表明SMs和LysoSMs的代謝降解也被加強。與對照組相比，PEs水平在SCCPs暴露組中顯著降低，而在MCCPs和LCCPs暴露組中則沒有明顯變化；LysoPEs在SCCPs暴露組中無明顯變化，在MCCPs和LCCPs暴露組中則顯著升高。此結果表明，3種氯化石蠟暴露均引起了PEs水解生成LysoPEs的反應增強，并且MCCPs和LCCPs暴露可能抑制了PEs向PCs的轉化。溶血磷脂含量的升高會導致細胞膜流動性增強，從而影響膜脂蛋白的有序性，破壞細胞膜結構，進而導致細胞死亡[23]。在本研究中，氯化石蠟暴露導致LysoPCs和LysoPEs含量的升高，可能是導致細胞增殖活性降低的原因之一。此外，筆者前期的研究也觀察到SCCPs暴露顯著提高了磷脂酶A2(PLA2)的活性，該酶用于調節磷脂轉化為溶血磷脂，可引起HepG2細胞內磷脂代謝的加強[24]。

2.5 對脂肪酸代謝的影響

脂肪酸是細胞膜的重要組成成分，同時也是機體最大的儲能物質。脂肪酸不能自由通過線粒體內膜和過氧化物酶體膜，需要肉堿作為載體[25]。脂肪酸首先在脂酰輔酶A合成酶的作用下生成脂酰輔酶A，脂酰輔酶A與游離肉堿在脂酰肉堿轉移酶Ι的催化下生成脂酰肉堿，脂酰肉堿進入線粒體和過氧化物酶體后在脂酰肉堿轉移酶Ⅱ的作用下，重新釋放游離肉堿與脂酰輔酶A，從而進行后續的脂肪酸氧化反應。如圖5所示，在本研究中，短、中和長鏈氯化石蠟暴露導致細胞培養液中總脂肪酸(∑FFAs)、長鏈脂肪酸(LC-FAs)、極長鏈脂肪酸(VLC-FAs)、飽和脂肪酸(SFAs)和不飽和脂肪酸(USFAs)的含量均顯著升高，并且3個暴露組之間的脂肪酸水平沒有顯著差異。此結果說明，3種氯化石蠟對脂肪酸代謝具有相似的干擾效應。此外，研究還發現，3種氯化石蠟均顯著降低了細胞培養液中游離肉堿的含量，提高了短、中和長鏈脂酰肉堿的含量(SC-ACs、MC-ACs和LC-ACs)。這些結果說明，氯化石蠟暴露抑制了細胞的脂肪酸代謝[26-27]。這可能是因為氯化石蠟暴露增強了脂酰肉堿轉移酶Ι的活性，但是抑制了脂酰肉堿轉移酶Ⅱ的活性，從而導致細胞游離肉堿含量降低，脂酰肉堿含量升高，總體上抑制了脂肪酸β氧化。

圖4 短、中和長鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞磷脂代謝的影響注：C為對照組，S為SCCPs暴露組，M為MCCPs暴露組，L為LCCPs暴露組；PCs表示磷脂酰膽堿，LysoPCs表示溶血磷脂酰膽堿，GP-C表示甘油磷脂膽堿，PEs表示磷脂酰乙醇胺，SIP表示1-磷酸鞘氨醇，LysoSM表示溶血鞘磷脂，SMs表示鞘磷脂，LysoPEs表示溶血磷脂酰乙醇胺；*和**分別表示與對照組相比顯著性差別在0.05和0.01水平。Fig. 4 Effects of exposure to SCCPs, MCCPs and LCCPs on phospholipid metabolism of HepG2 cellsNote: C. Control group; S. SCCP exposure group; M. MCCP exposure group; L. LCCP exposure group; PCs stands for phosphatidyl cholines; LysoPCs stands for lysophosphatidyl cholines; GP-C stands for glycerol-3-phosphocholine; PEs stands for phosphatidyl ethanolamines; SIP stands for sphingosine 1-phosphate; LysoSM stands for lysosphingomyelins; SMs stands for sphingomyelins; LysoPEs stands for lysophosphatidyl ethanolamines; * and ** indicate the significant differences at 0.05 and 0.01 levels in comparison to the control.

圖5 短、中和長鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞脂肪酸代謝的影響注：C為對照組，S為SCCPs暴露組，M為MCCPs暴露組，L為LCCPs暴露組；∑FFAs表示總脂肪酸，LC-FAs表示長鏈脂肪酸，VLC-FAs表示極長鏈脂肪酸，SFAs表示飽和脂肪酸，USFAs表示不飽和脂肪酸，Free camitine表示游離肉堿，SC-ACs表示短鏈脂酰肉堿，MC-ACs表示中鏈脂酰肉堿；LC-ACs表示長鏈脂酰肉堿；*和**分別表示與對照組相比顯著性差別在0.05和0.01水平。Fig. 5 Effects of exposure to SCCPs, MCCPs and LCCPs on fatty acid metabolism of HepG2 cellsNote: C. Control group; S. SCCP exposure group; M. MCCP exposure group; L. LCCP exposure group; ∑FFAs stands for total fatty acids; LC-FAs stands for long-chain fatty acids; VLC-FAs stands for very long-chain fatty acids; SFAs stands for saturated fatty acids; USFAs stands for unsaturated fatty acids; SC-ACs stands for short-chain acyl-carnitines; MC-ACs stands for medium-chain acyl-carnitines; LC-ACs stands for long-chain acyl-carnitines; * and ** indicate the significant differences at 0.05 and 0.01 levels in comparison to the control.

2.6 對氨基酸代謝的影響

氨基酸是蛋白質的基本組成單元，在生物體內發揮重要作用。在本研究中，代謝通路富集分析揭示了3種氯化石蠟暴露對HepG2細胞氨基酸代謝的顯著影響。圖6顯示了12種差異氨基酸在胞外培養液中水平的變化情況。暴露24 h后，胞外培養液中總氨基酸含量顯著升高，并且短、中和長鏈氯化石蠟暴露組中每一種差異氨基酸的含量變化趨勢一致。精氨酸、甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蘇氨酸為培養液中添加的營養物質，其中只有蘇氨酸的含量是顯著降低的，其余均顯著升高。此結果表明，3種氯化石蠟暴露均抑制了細胞的氨基酸跨膜運輸。LCCPs具有更強親脂性，可能更易與細胞膜的磷脂雙分子層結合，破壞細胞膜的流動性[28]，因而對氨基酸的跨膜運輸產生更強的抑制效應，并因此更強烈地干擾了氨基酸代謝(圖3)。細胞培養液中沒有添加谷氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸，檢測出的谷氨酸、鳥氨酸和瓜氨酸為細胞合成物質。如圖6所示，3種氯化石蠟暴露均引起了谷氨酸和鳥氨酸含量的顯著降低，瓜氨酸含量的變化不明顯，表明細胞內的氨基酸合成代謝可能受到了抑制。

與人體內暴露水平接近(100 μg·L-1)的短、中和長鏈氯化石蠟暴露顯著降低了HepG2細胞的增殖活性，并且顯著干擾了細胞代謝。短、中和長鏈氯化石蠟均顯著影響了細胞的磷脂代謝、脂肪酸代謝和氨基酸代謝。主要受干擾的代謝通路包括：甘油磷脂代謝、亞油酸代謝、α-亞麻酸代謝、花生四烯酸代謝和鞘磷脂。短、中和長鏈氯化石蠟對磷脂代謝和脂肪酸代謝的擾亂程度相近，均加強了細胞磷脂代謝，抑制了脂肪酸的代謝。與SCCPs和MCCPs相比，LCCPs對氨基酸代謝產生了更強的干擾效應。以上結果不支持MCCPs和LCCPs作為SCCPs的代替物使用。

圖6 短、中和長鏈氯化石蠟暴露對HepG2細胞氨基酸代謝的影響注：C為對照組，S為SCCPs暴露組，M為MCCPs暴露組，L為LCCPs暴露組；*和**分別表示與對照組相比顯著性差別在0.05和0.01水平。Fig. 6 Effects of exposure to SCCPs, MCCPs and LCCPs on amino acid metabolism of HepG2 cellNote: C. Control group; S. SCCP exposure group; M. MCCP exposure group; L. LCCP exposure group; * and ** indicate the significant differences at 0.05 and 0.01 levels in comparison to the control.