丹參川芎嗪對離體大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護作用

黃文東 楊艷芳 高 琦 李啟森 朱邦豪▲

1.廣東省茂名市人民醫院藥劑科，廣東茂名 525000；2.廣東省茂名市人民醫院中心實驗室，廣東茂名 525000；3.中山大學中山醫學院心腦血管研究中心，廣東廣州 510080

心肌缺血/再灌注（ischemia-reperfusion，I/R）造成的心肌可逆性或不可逆性的損傷是缺血性心臟病最嚴重的損傷類型，隨著介入和溶栓技術的廣泛應用，I/R導致損傷目前已成為心血管疾病防治領域的重要問題之一[1-3]。川芎嗪（Ligustrazine）是中藥川芎的有效成分之一，有報道川芎嗪具有清除氧自由基抑制脂質過氧化，抑制細胞凋亡，保護心肌細胞，干擾炎癥反應，保護心肌細胞等作用[4-5]。同時丹參素（Salvia miltiorrhiza）為唇形科植物丹參的干燥根及根莖的有效成分，主要用于治療心血管疾病，如心絞痛、心肌梗死和中風[6]，體內外研究表明，丹參素具有多種藥理作用，包括舒張冠狀動脈、抗凝、保護心肌缺血損傷、抗心律失常等[7-8]。目前丹參素和川芎嗪廣泛應用于臨床上，近年來出現了丹參川芎嗪注射液等復方制劑，課題組前期已研究丹參川芎嗪對大鼠在體心肌缺血/再灌注損傷具有保護作用[9]，本實驗主要通過構建大鼠離體模型，從離體的角度探討丹參川芎嗪對離體心肌缺血/再灌注損傷的影響，為臨床使用提供理論依據。

1 資料

1.1 一般資料

選用SPF級SD雄性大鼠55只，隨機分為五組（n=11），空白對照組的體重（265.38±10.44）g，日齡（49.9±1.12）d，模型組的體重（267.72±11.21）g，日 齡（50.2±1.31）d，SLI高 劑 量 組 的 體 重（264.18±12.37）g，日齡（49.1±1.35）d，中劑量組的體重（265.27±11.95）g，日齡（49.8±1.45）d，低劑量組的體重（269.72±10.19）g，日齡（50.3±1.32）d，各組一般資料比較，差異無統計意義（P＞0.05），具有可比性。購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2013-0020。于中山大學中山醫學院實驗動物中心（合格證為粵監證字2012C012號）進行動物飼養及實驗。

1.2 藥品和試劑

丹參川芎嗪注射液（吉林四長制藥有限公司，20170108）。肝素（500U/kg），河北常山生化；戊巴比妥鈉，德國Merok公司生產；乳酸脫氫酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒，購于南京建成生物醫學工程研究所。其他試劑購于廣州市化學試劑廠。

1.3 主要儀器

PL202-S電子天平[梅特勒-托利多（上海）有限公司]；BL-420S生物機能實驗系統（成都泰盟）；langendorff離體心臟灌流儀（澳洲ADI公司）；高速冷凍離心機（Beckman，US）；酶標儀（MJ Research，US）；倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠，CN）。

2 方法

2.1 實驗分組

SD大鼠55只，隨機分為五組（n=11），分別是空白對照組（Control）、模型組（Model）、SLI高劑量組（High）、中劑量組（Middle）、低劑量組（Low）。臨用前將受試物溶于灌流液中，使高中低劑量組的終濃度分別為 2.5、1.25、0.625mL/L。

2.2 Langendorff離體心臟模型制備

2.2.1 Krebs-Henseleit（K-H）灌流液配方（mmol/L）[10]NaCl 118.0，KCl 4.7，MgSO4·7H2O 1.2，NaHCO325.0，KH2PO41.2，CaC122.5，葡萄糖 11.0，牛血清蛋白 0.25，PH7.4。

2.2.2 操作步驟 參考已發表文章[10-11]方法，SD大鼠腹腔注射肝素鈉（50U/kg）行肝素化抗凝，15min后腹腔注射戊巴比妥鈉（50mg/kg）麻醉后，開胸將心臟迅速取出，轉移到4℃（K-H）灌流液的玻璃皿中，輕輕擠出殘留血液，同時快速用線繩將主動脈固定于體外灌流的套管上。提前設定恒溫循環器（37±0.5）℃，用 95%O2和 5%CO2混合氣體飽的灌流液進行恒壓灌流，灌注壓為60mm Hg，在左心室內放置球囊連接壓力傳感器測定心室內壓，用蛙心夾夾住心尖部和乳突部連接傳感器檢測心電圖。模型組用正常灌流液灌注，平衡20min后，停止灌注20min，復灌60min。給藥組分別在停灌前用含有2.5、1.25、0.625mL/L的灌流液灌注10min后，全心停灌20min，再灌注60min；空白對照組連續灌流100min。

2.3 監測指標

2.3.1 心功能參數 使用labchart生物信號采集儀器記錄各組受試藥物對左心室收縮壓（LVSP）、左心室舒張壓（LVEDP）、心率（HR）、左心室內壓最大上升、下降速率（+dp/dtmax、-dp/dtmax）心功能指標的影響。

2.3.2 冠脈流量 人工測量離體心臟的冠脈流量（CF），分別收集缺血前及再灌后 15、30、60min時1min內的冠脈流出液，用量筒測量體積，單位以mL/min表示。

2.3.3 檢測冠脈流出液中LDH、CK、SOD、MDA的活性 使用1.5mL離心管收集特定時間點的冠脈流出液，并快速置于-80℃冰箱凍存。待全部標本收集完成后再用相應的試劑盒測定目標檢測物的生物活性。

2.3.4 HE染色切片觀察心肌損傷情況 待離體心臟灌流結束后摘下大鼠心臟，并將心臟置于4%多聚甲醛的離心管固定3d，然后制成石蠟包埋切片，根據大鼠心肌紋路連續切5片，并進行HE染色，在倒置顯微鏡下觀察相應組別的心肌情況。

2.4 統計學處理

采用SPSS13.0統計分析軟件對數據進行統計分析，計量資料以（±s）表示，采用 t檢驗，兩組以上變量比較采用方差分析，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠離體心臟血流動力學影響

缺血/再灌注后各時間點檢測結果顯示，模型組的LVSP、HR、±dp/dtmax相較于空白組顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，SLI高劑量組的LVSP在 30min后明顯升高（P=0.022）；SLI高劑量組的LVEDP在缺血/再灌注30min后明顯降低（P=0.003）。SLI高劑量組的±dp/dtmax在缺血/再灌注30min后明顯升高，其中+dP/dtmax與模型組相比（P=0.019），-dP/dtmax與模型組相比（P=0.028），差異均有統計學意義（P＜0.05）。缺血/再灌注30min后高劑量組的HR相較于模型組顯著升高（P=0.005），差異均有統計學意義（P＜0.01）。由此可知SLI能有效改善心肌缺血/再灌注損傷對心臟舒縮功能的抑制作用。見表1。

表1 SLI對缺血/再灌注心肌相關指標的影響（±s）

表1 SLI對缺血/再灌注心肌相關指標的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

指標 組別 基準 復灌30min LVSP（mm Hg）空白對照組 110.64±10.16 110.56±15.29模型組 106.99±5.42 80.91±9.48高劑量組 112.34±10.84 91.51±17.08*中劑量組 102.66±10.96 87.59±11.13低劑量組 105.73±16.69 78.93±17.85 F 0.557 2.794 P 0.696 0.041 LVEDP（mm Hg）空白對照組 10.86±4.96 9.65±3.65模型組 8.06±12.23 33.69±18.48高劑量組 10.16±1.90 24.52±9.23*中劑量組 10.56±7.18 32.83±10.43低劑量組 10.13±15.57 35.31±15.72 F 1.792 6.691 P 0.153 0.000 HR（次/min）空白對照組 219.43±25.82 220.68±43.72模型組 189.00±27.55 143.18±18.51高劑量組 213.22±45.99 201.92±9.75**中劑量組 198.79±44.44 186.82±9.00*低劑量組 187.15±58.40 159.63±61.18 F 1.039 33.466 P 0.401 0.001+dP/dtmax（mm Hg/s）空白對照組 3243.92±279.10 3217.43±323.78模型組 3119.23±268.97 1459.09±387.25高劑量組 3161.91±299.43 1705.47±284.33*中劑量組 3050.13±348.50 1637.78±282.72低劑量組 3251.74±322.38 1480.67±501.42 F 0.672 31.460 P 0.783 0.001-dP/dtmax（mm Hg/s）空白對照組 3550.64±220.89 3528.54±314.50模型組 3379.87±127.87 1643.16±257.81高劑量組 3617.76±195.02 2100.81±147.76*中劑量組 3419.22±155.18 1914.35±341.95低劑量組 3534.28±375.37 1765.13±208.66 F 0.631 33.519 P 0.895 0.001

3.2 冠脈流量的影響

在穩定灌流條件下，空白對照組前后的灌流量基本保持平穩，缺氧再復灌30min后，與模型組比較，高劑量組有顯著性增加（P=0.001），差異有統計學意義（P＜0.05），而中劑量和低劑量組差異無統計學意義（P＞0.05），可知SLI能明顯改善大鼠離體心臟灌流量。見表2。

表2 SLI對心肌梗死冠脈流量（CF）的影響（±s，mL/min）

表2 SLI對心肌梗死冠脈流量（CF）的影響（±s，mL/min）

注：與模型組比較，*P＜0.05

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3.3 灌脈流出液中LDH、CK、MDA、SOD的生物活性測定

各組在停灌前，LDH、CK、SOD、MDA含量值與空白對照組相比較均無差異，在缺血處理20min后，再灌注30min時，SLI高劑量組LDH與模型組相比較（P=0.029），CK 值與模型組相比較（P=0.015），差異有統計意義（P＜0.05），中劑量組和低劑量組再灌注30min時，與模型組差異無統計學意義（P＞0.05）；缺血再灌注30min，高劑量組SOD值與模型組相比較（P=0.009）；而再灌注30min的MDA值則明顯降低（P=0.023）。結果顯示SLI各劑量組均能抑制心肌細胞LDH釋放，呈現出一定的量效關系。見表3。

3.4 HE染色光學顯微鏡研究SLI對心肌結構的影響

在顯微鏡下觀察，正常組的心肌細胞著色均勻，心肌橫紋肌排列整齊，胞膜完整，邊界清晰；模型組心肌細胞著色不均，纖維排列紊亂，心肌有斷裂，核裂解消失，部分區域水腫變性，心肌纖維間可見中性粒細胞浸潤，部分心肌細胞壞死。見圖1。

表3 SLI對大鼠心肌梗死LDH/CK/SOD和MDA的影響（±s）

表3 SLI對大鼠心肌梗死LDH/CK/SOD和MDA的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

指標 組別 基準 復灌30min LDH（U/L） 空白對照組 159.39±32.20 155.63±25.42模型組 145.32±25.21 296.18±18.74高劑量組 162.57±24.97 237.98±26.31*中劑量組 150.32±2.18 297.95±28.72低劑量組 153.74±8.15 287.21±15.86 F 0.571 45.528 P 0.162 0.005 CK（U/L） 空白對照組 1.42±0.14 1.48±0.91模型組 1.59±0.54 2.24±0.91高劑量組 1.67±0.32 1.64±0.37*中劑量組 1.41±0.28 1.91±0.32低劑量組 1.53±6.74 1.96±0.41*F 0.147 33.551 P 0.179 0.009 SOD（mg/L） 空白對照組 6.09±1.17 6.63±1.24模型組 5.72±2.15 4.18±1.74高劑量組 6.27±1.97 6.03±1.44**中劑量組 6.02±1.28 5.46±1.72*低劑量組 5.45±1.58 4.87±0.98 F 0.893 25.326 P 0.764 0.048 MDA（nmol/L） 空白對照組 9.37±0.49 11.76±0.86模型組 8.07±1.19 17.89±1.33高劑量組 9.07±1.42 13.71±1.67*中劑量組 8.65±1.68 15.61±5.32低劑量組 8.98±1.74 15.73±2.10 F 0.442 10.558 P 0.961 0.024

4 討論

心肌缺血/再灌注（I/R）損傷是指心肌缺血后再恢復血液供應，會引起心肌超微結構不可逆壞死現象。在心肌缺血再灌注過程中，雖然再灌注能夠改善血液供應，但會引起心肌超微結構、功能、代謝及電生理方面發生進一步的損傷而導致病情惡化。目前的研究顯示心肌缺血/再灌注損傷的機制與自由基增多、細胞內鈣超載、微血管損傷等有關[12-14]，心肌缺血再灌注過程中由于局部心肌缺血缺氧，在恢復灌注過程中氧氣供應充足，產生大量的氧離子、氫氧根等，這些成分可能是引起心肌缺血/再灌注損傷的主要因素之一[15-16]。

圖1 不同處理組心肌組織切片的HE染色結果圖

本課題主要研究SLI對離體心臟模型的血流動力學以及心肌酶等指標的影響，結果表明SLI能通過影響血流動力學指標和心率，以提高心肌供氧量，改善心功能。通常胞質酶如AST、LDH和CK作為心肌缺血損傷的診斷標志物，在誘導細胞膜滲透或破裂時，從受損的心肌組織中泄漏到血液中[17-18]。因此，血清中AST、LDH和CK的活性能夠反映膜完整性的改變和心肌損傷的程度。在本研究中，我們發現SLI劑量組依賴性地降低I/R損傷引起的LDH和CK水平升高，提示SLI可以抑制急性心肌缺血損傷的細胞膜損傷。

據報道，氧化應激是導致心肌損傷的主要原因[19-21]。過量的氧自由基導致脂質過氧化過程。SOD是機體清除氧自由基、減少自由基產生和心肌細胞H/R損傷的第一道防線。MDA是脂質過氧化的主要終產物，其濃度可以反映心肌損傷程度[22-23]。在我們的研究中，SLI不僅顯著降低了MDA含量，而且增加了SOD酶活性。結果表明，SLI能增強清除氧化自由基的能力，至少在一定程度上能減少心肌損傷。

本實驗HE染色顯示，模型組心肌損傷引起心肌細胞膜損傷，心肌壞死、肌腱有斷裂，纖維排列紊亂，核碎裂、消失，胞質紅染，呈現不規則粗顆粒狀，炎性細胞浸潤，染色質凝結、胞質空泡和肌纖維丟失。SLI可消除心肌細胞膜損傷，偶爾出現肌纖維丟失和炎性細胞浸潤，明顯縮小壞死灶，明顯減弱壞死程度。結果顯示，SLI對缺血/再灌注的心肌組織具有的一定保護作用。

綜上所述，我們的研究首次表明，SLI能減輕心肌再灌注所造成的損傷，主要是通過調節心肌酶對大鼠心肌I/R損傷具有顯著的心肌保護作用，增強了清除氧化自由基的能力。