體育場館內PM2.5的環境行為與急性毒理效應對運動大鼠免疫指標的影響

李峰，由文華，劉沅龍

1. 西安建筑科技大學體育學院，西安 710055 2. Department of Human Performance and Health Education, Western Michigan University, Kalamazoo, Michigan 49008, USA

體育館內PM2.5的來源主要包括外源性和內源性2種，其中外源性主要包括場館門窗、圍護結構縫隙進入和人員出入時帶入等方式[1]；內源性主要包括運動器械設備磨損后產生的顆粒物，館內人員通過皮膚代謝物、呼吸和服裝攜帶的顆粒物，以及場館內人員移動蕩起的揚塵等[2]。場館內顆粒物的特征主要表現為來源成分復雜、積累時間長、不容易散發、濃度波動范圍小和沉淀速度慢[3]，這種館內外顆粒物的污染源共同構成了館內的污染物散發網絡。大氣細顆粒物的環境行為和健康效應與其物理化學性質有關，例如數濃度、質量濃度、粒徑分布和化學組分等[4]。以往研究表明，作為復合型大氣污染環境中的主要污染物，PM2.5具有一定的免疫毒性，對運動時各系統組織器官具有較強的損害效應[5]，能引起機體免疫系統疾病，其主要包括炎癥反應損傷[6]、免疫損傷[7]、細胞自噬和凋亡等[8]。喬玉成和張琦[9]研究發現，運動過程中的呼吸方式改變、呼吸頻率增加、肺擴散能力增強和產熱量增加是人體運動狀態比安靜狀態更容易遭到損傷的原因。暴露于PM2.5污染環境下運動，呼吸系統和血液循環系統受到的污染效應與其沉積的污染量有關[10]。樊西寧研究發現[11]，沉積率與呼吸頻率、呼吸量成正比，呼吸頻率、呼吸量值越大，沉積率的值就越高，污染效應就越大。機體的免疫系統是防御外來有害物質入侵的屏障，因此，研究PM2.5的環境行為、在機體內的轉化行為、生物代謝機制以及對運動狀態下機體的炎性損傷及其機制，可以為今后在污染環境下運動的可行性評估和人群運動防護提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 PM2.5的采樣及懸液制備[12]

在某校綜合體育館內用TH-150 C型(武漢天虹)顆粒物智能采樣器采集PM2.5，采樣時保證采樣點周圍無堆積物以防遮擋空氣流通，同時保證采集點為非污染源。為模仿人體呼吸帶的高度，采樣時使儀器放置高度為1.5 m，即人體呼吸帶高度，采用同心圓方式選取5個點，2點之間相距5 m左右，離墻>1 m、離門窗>3 m，空氣流量為1.13 m3·min-1。按照儀器操作規則，使采氣流量保持定值，每天24 h連續采樣，持續30 d，根據采樣前、后濾膜質量差和采樣體積得出顆粒物的質量濃度。采樣時將已稱重的濾膜用鑷子放入結晶采樣夾的濾網上，濾膜毛面朝進氣方向，將濾膜壓緊至不漏氣。采樣完畢后將PM2.5收集在玻璃纖維濾膜上，然后將濾膜裁剪為小塊后浸入去離子水中，經超聲振蕩30 min×4次后用去離子水洗脫顆粒物，然后將濾液在4 ℃離心20 min(速度1 000 r·min-1，離心半徑59 mm)，真空干燥后稱重，-20 ℃保存。為保證顆粒物實際毒性效果，實驗并未對顆粒物進行消毒滅菌處理，染毒前用0.9%生理鹽水配制成需要的濃度，使用前超聲振蕩15 min使染毒懸液均勻，并滅菌備用。

1.2 實驗動物染毒劑量與染毒方式

PM2.5采用氣管滴注法染毒，室內溫度保持在20～26 ℃之間，濕度為44%～70%。滴注前受試物的溫度維持在37 ℃左右，將染毒懸液預溫至37 ℃，在乙醚麻醉后，3組實驗動物分別按低(7.5 mg·kg-1)、中(15 mg·kg-1)和高(30 mg·kg-1)劑量經氣管注入PM2.5顆粒物染毒懸液，滴注體積為3 mL·kg-1(體重)，對照組滴注同等容量的生理鹽水，實驗大鼠染毒后1 h進行運動。

1.3 實驗動物分組與運動方案

實驗動物選用7周齡SPF級(specific pathogen free, SPF)健康成年雄性Wistar大鼠32只(由西安交通大學醫學院動飼養中心提供)，體重180～220 g。動物購回后在常規飼養籠內適應性喂養7 d，飼養室內溫度20～26 ℃、濕度為44%～70%，自由進食和飲水(飼料購自西安交通大學醫學院動物房)，照明隨同光照自然變化。所有動物均依照《關于善待實驗動物的指導性意見》的相關要求進行處置[13]，染毒時間為訓練前1 h。訓練前將大鼠隨機分為4組，分別為運動對照組(EC)、低劑量(7.5 mg·kg-1)運動組(LPE)、中劑量(15 mg·kg-1)運動組(MPE)和高劑量(30 mg·kg-1)運動組(HPE)，每組8只，根據大鼠體重/攝氧量回歸方程建立遞增負荷運動模型，正式訓練前將所有實驗大鼠先進行2 d的適應性訓練，速度和時間分別以10 m·min-1、5 min·d-1進行，訓練方式為跑臺；然后所有動物進行1 d的訓練前恢復，隨后按照15 m·min-1、15 min(相當于45%最大攝氧能力)，18 m·min-1、20 min(相當于50%最大攝氧能力)，21 m·min-1、30 min(相當于65%最大攝氧能力)，24 m·min-1、40 min(相當于70%最大攝氧能力)，27 m·min-1、50 min(相當于76%最大攝氧能力)的遞增負荷形式進行。

1.4 血清和肺泡灌洗液(BALF)制備與指標測試

實驗結束后即刻用20%烏拉坦溶液腹腔注射麻醉后處死大鼠，腹主動脈取血，肝素抗凝，37 ℃恒溫水浴5 min后3 500 r·min-1離心15 min，分離血清并于4 ℃冰箱保存備用。克拉拉細胞蛋白(CC16)、超敏C反應蛋白(hs-CRP)、大鼠單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)、大鼠巨噬細胞炎癥蛋白1α(MIP-1α)和中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)的檢測均采用雙抗體夾心法(ABC-ELISA)，使用儀器為日本Olympus AU 400全自動生化分析儀，ELISA試劑盒購自上海雅吉生化試劑六廠，所有操作均嚴格按說明書進行。

2 結果(Results)

2.1 PM2.5對大鼠血清中免疫蛋白的影響

由表1可知，和EC組相比，LPE、MPE和HPE中MCP-1、MIP-1α和hs-CRP隨劑量增加而升高，NE和CC16則隨劑量增加而降低。

2.2 PM2.5對大鼠BALF中免疫蛋白的影響

表2數據顯示，和EC組相比，隨著PM2.5滴注劑量的增加，LPE、MPE和HPE組MCP-1、MIP-1α和hs-CRP表現出升高趨勢，差異均有統計學意義(P<0.05、P<0.01)，NE和CC16則隨著PM2.5劑量的升高而降低。

注：EC表示運動對照組，LPE表示低劑量運動組，MPE表示中劑量運動組，HPE表示高劑量運動組；MCP-1表示單核細胞趨化蛋白-1，MIP-1α表示巨噬細胞炎癥蛋白，hs-CRP表示超敏C反應蛋白，NE表示中性粒細胞彈性蛋白酶，CC16表示克拉拉細胞蛋白；與EC比較，*P<0.05、**P<0.01。
Note: EC represents exercise control group; LPE represents low-dose exercise group; MPE represents middle-dose exercise group; HPE represents high-dose exercise group; MCP-1 represents monocyte chemoattractant protein-1; MIP-1α represents macrophage inflammatory protein-1α; hs-CRP represents hypersensitive C-reactive protein; NE represents neutrophil elastase; CC16 represents Clara cell protein 16; compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

注：與EC比較，*P<0.05、**P<0.01。
Note: Compared with EC,*P<0.05,**P<0.01.

3 討論(Discussion)

3.1 PM2.5的環境行為對血清和BALF中MCP-1、MIP-1α和hs-CRP的影響

袁鵬和安蕾[14]研究發現，PM2.5可以富集包含有機物、酸性氧化物、重金屬、細菌和病毒等有害物質進入呼吸道，甚至通過血液循環進入全身各系統，對機體造成傷害。尤其是在運動狀態下，人的呼吸以及各種帶香味的護理用品會散發檸檬烯等萜烯類化合物，萜烯類化合物也能與O3反應產生顆粒物，從而導致顆粒物濃度增加[15]。同時，運動人群裸露的皮膚、毛發和皮膚油的某些成分作為場館內顆粒物的內源性來源可以與O3快速反應生成超細顆粒物(ultra-fine particules, UFPs)，而UPFs是一類以惰性碳為中心的顆粒物，具有極大的比表面積且有著很強的核吸附能力，可以損壞肺泡巨噬細胞清除有害物質的能力，并能通過上皮屏障，釋放大量的炎性介質從而引起更強炎性反應[16]。

在運動過程中隨著呼吸的加深加快導致機體的肺活量和肺通氣效率都增加，以滿足機體運動的需要，但同時也必然會吸入更多的PM2.5。MCP-1趨化因子是一類參與機體多種機能活動的重要免疫應答調節因子，在急性組織損傷中也發揮著重要的作用，具有誘導單核細胞趨化和激活單核細胞的雙重功效[17]。除了細胞免疫反應之外，MCP-1還可以構成早期抵御微生物侵入的防線[18]，誘導單核細胞表面粘附分子及細胞因子白細胞介素1 (IL-1)和白細胞介素6(IL-6)的表達，調節單核細胞的多種功能[19]。本實驗研究結果顯示，急性PM2.5暴露對運動大鼠部分血清免疫蛋白產生不利影響，且不同劑量的PM2.5所引起的機體免疫反應是不相同的，具體表現在隨著PM2.5暴露劑量的增加，血清和BALF中MCP-1表現出劑量相關性升高趨勢；相應機制可能是由于PM2.5進入機體后具有一定的生物蓄積行為，其所含的各種有害物質會對組織細胞的抗氧化酶及內穩態造成破壞，通過氧化應激反應相關轉錄因子刺激前炎性細胞素的釋放，引發炎癥反應失衡[20]。PM2.5中的有機污染物由于具有較強的疏水性，進入機體后可以與機體內各種免疫因子、免疫蛋白結合[21]，使得PM2.5的遷移、分配和生物反應等出現不穩定性的生物-化學危害效應。

由于MIP-1α在炎癥、創傷等刺激下出現炎癥性表達，參與機體的應激反應[22]。因此，在運動大鼠接受PM2.5暴露和短時間大強度應激2種刺激后，血清和BALF中MIP-1α表達增加，可能是PM2.5作用機體后產生的一系列因素綜合作用的結果，比如氧化應激、信號傳導、細胞因子的產生和脂質過氧化等[23]。

hs-CRP作為機體對外界環境污染、運動應激時分泌的急性應激免疫細胞因子，是免疫網絡的重要組成部分，它的表達與分泌不僅與免疫細胞的分化增殖和功能發揮密切相關，也是評價呼吸道上皮屏障功能的早期敏感指標，可以反映呼吸道的損傷程度及肺-血屏障的完整程度[24]。PM2.5暴露后運動大鼠血清和BALF中hs-CRP升高，且低劑量組和高劑量組中hs-CRP與對照相比差異有統計學意義，其原因可能是由于PM2.5的毒性作用增加了運動過程中血管內皮細胞表面可溶性細胞間黏附分子的表達。由于hs-CRP是一種的急性應激蛋白，其水平的高低反映了應激反應的強弱[25]，組織間通過直接(浸潤、聚集)或間接(產生細胞因子)作用，引起一定部位的組織損傷和炎癥反應[26]。

3.2 不同劑量PM2.5對血清和BALF中NE和CC16的影響

場館內外PM2.5在呼吸系統的沉積濃度會有差別，但是在不同器官的沉積效率卻較為相似[27]。實驗研究發現，顆粒物在鼻腔咽喉部的沉積部分最大，但是真正對機體造成損害的沉積部位卻是肺泡部位[28]。因為細顆粒物可以通過肺部的血液循環到達全身各處。因此，本實驗中BALF和血液中免疫指標的變化可以很大程度上代表PM2.5對機體其他器官的免疫損害。

CC16作為肺上皮細胞的特異性蛋白，可以保護呼吸道、抵御氧化應激和免疫調節等，同時也是評價呼吸道上皮屏障功能的早期敏感指標，具有抗炎、抗纖維化及活躍的增殖分化能力[29]。本研究結果顯示，與EC組相比，CC16隨著PM2.5劑量的增加而降低且有統計學意義。這表明，在此運動模型中PM2.5暴露可以破壞機體的肺-血屏障的完整程度[30]，造成肺上皮細胞膜的通透性增加，從而使蛋白從血管外滲透到血管內，對呼吸系統造成損傷。

NE在體外循環引起的組織器官損害中起著重要作用，其作為判斷組織免疫損傷強度的一個指標，NE指標的變化反映了機體免疫系統對外界刺激反應能力的敏感程度[31]。機體免疫系統受到外源性刺激的大小、炎性介質釋放量的多少以及組織損傷的程度都與NE的釋放量有關。本實驗結果顯示，大鼠在PM2.5暴露的刺激下NE的含量降低，表明機體PM2.5可破壞細胞間的緊密連接和基底膜的完整性，使血管通透性增加，加重氣道炎癥，導致一過性氣道狹窄及阻塞，引起通氣功能下降[32]，同時機體的中性粒細胞在PM2.5的刺激下會釋放較少的炎性介質，這在免疫學上稱為初始啟動[33]，當作為免疫應激反應的免疫蛋白過多時，會使免疫系統受到疊加效應，如果這種疊加效應超過了神經-內分泌-內穩態的控制水平，則分解細胞外基質，導致炎癥發生遷移。

綜上，機體的免疫反應與PM2.5環境行為和代謝毒理之間存在著直接的耦合關系，且受到多種因素的影響。PM2.5在組織細胞內的粘附、遷移和毒性作用導致的細胞形變會驅動細胞膜脂質重組，改變細胞膜間隙的通過能力。BALF和血清分別作為肺組織和血液循環系統的代表，其機械屏障會受到PM2.5的攻擊入侵。而免疫蛋白作為免疫應激反應的標志性蛋白，不同劑量的PM2.5暴露對大鼠免疫指標的影響可以有效指示運動大鼠暴露于環境污染物的健康風險。MCP-1、MIP-1α、hs-CRP、NE和CC16的變化也進一步解釋了PM2.5對生物體致炎作用的機制與免疫蛋白的表達水平有關。