4種農藥復合污染對斑馬魚仔魚聯合毒性效應

郭東梅，李耘，邱靜，許彥陽，楊桂玲，王強， 錢永忠,*

1. 浙江省農業科學院農產品質量標準研究所，杭州 310021 2. 中國農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所，北京 100081

農藥在防治農作物病、蟲和草害、促進農作物生長和保證增產增收方面起了積極作用。但是大量使用的農藥可以通過雨水沖刷等不同的途徑進入水體，污染水資源，給水生生態系統和人類健康造成嚴重影響[1-3]。氯氰菊酯被廣泛用于防治棉花、水果和蔬菜等的多種害蟲[4-5]。氯氰菊酯雖然在土壤中有較高的疏水性和較高的穩定性，但是它很容易通過徑流和土壤侵蝕運輸到水生態系統中[6-7]。馬拉硫磷是一種常用的有機磷類殺蟲劑，用以防治水果、蔬菜上的主要蟲害[8-9]。殺螟硫磷具有神經毒性，可抑制膽堿酯酶和刺激神經系統[10]。咪鮮胺是一類被廣泛應用的咪唑類殺菌劑，能夠抑制麥角甾醇生物合成[11-15]。在水生態環境中，農藥往往是以復合污染物的形式存在。氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺等大量使用，其殘留污染在水生環境中時常被檢測到[16-17]，且經常共存于水體中。

斑馬魚個體小，繁殖周期短，胚胎透明便于觀察，與人類基因同源性高達87%以上，因此，在毒理學研究中常作為模式生物。目前，關注單一污染物毒性作用的研究較多，而探究污染物聯合毒性效應的相對較少[18]。筆者以斑馬魚仔魚為模式生物，研究了氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺對斑馬魚仔魚的急性毒性，以及4種農藥的二元、三元和多元復合污染對斑馬魚仔魚的聯合毒性效應，以期為復合污染的生態毒理學評估提供一定的毒理學數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器和試劑

24孔細胞培養板(浙江拱東醫療科技有限公司)；光照培養箱(三洋MLR-350HT)；體視顯微鏡(Leica L2型)。

95%氯氰菊酯乳油、97%咪鮮胺粉劑和95%馬拉硫磷乳油由南京紅太陽有限公司生產；95%殺螟硫磷乳油由臺州黃巖永寧農藥化工有限公司生產；純度為99%的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)由天津市福晨化學試劑廠生產；純吐溫-80由國藥集團化學試劑有限公司生產。

氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺原藥用吐溫-80和DMF溶解，經超聲混勻定容配制為10 000 μg·L-1的母液，放在-4 ℃冰箱中備用。

1.2 實驗材料

斑馬魚AB品系購買于武漢中國科學院水生生物研究所國家斑馬魚資源中心。斑馬魚分別在每天早、中和晚喂食新孵化的豐年蝦。魚飼養在活性炭過濾并充分曝氣的水循環系統中，水溫為(26±1) ℃，pH為8.34，光/暗比為14 h∶10 h，總硬度為28～32 DH。本試驗所用斑馬魚仔魚為種魚繁殖所得。在倒置顯微鏡下挑選各臟器都已形成、無異常受精后6日齡的仔魚進行毒性試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1 單一農藥對斑馬魚仔魚染毒試驗

參考OECD TG 203[19]方法，將氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺母液分別用實驗室的曝氧水以1.5倍濃度梯度間隔稀釋成一系列梯度溶液。采用24孔細胞培養板，每孔加入2.5 mL測試溶液，并移入一個發育正常的仔魚。以稀釋水為空白對照組，1個24孔板為1個重復，每個濃度設3次重復。為了防止溶液揮發，測試的24孔細胞培養板用膠帶密封。

染毒期間，仔魚放入溫度為(26±1) ℃、光/暗比為14 h∶10 h的恒溫培養箱中。在染毒試驗期間，仔魚不被喂養。為了確保試驗期間藥劑濃度不變，每隔24 h更換藥液一次，并于染毒后的24、48、72和96 h觀察仔魚死亡數。在顯微鏡下觀察，仔魚無心跳被判斷為死亡(OECD, 1998)[20]。

1.3.2 農藥混合污染對斑馬魚仔魚染毒試驗

氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺的二元、三元及多元混合污染對斑馬魚仔魚的聯合毒性測試，依據單一農藥對斑馬魚仔魚96 h-LC50值為一個毒性單位，按照等毒比(1∶1)進行混合配制。混合農藥用實驗室的曝氧水以1.5倍濃度梯度間隔稀釋成一系列梯度溶液，試驗具體方法同1.3.1部分。

1.3.3 數據處理

根據斑馬魚仔魚在一定濃度下的死亡數，利用DPS軟件計算農藥的毒力回歸方程，并確定農藥的LC50值及其95%置信限。

采用Marking相加指數法[21]來判定農藥的聯合毒性。生物毒性作用之和(S)計算公式為S=Am/Ai+Bm/Bi+Cm/Ci，式中：Am、Bm和Cm分別為混合物中各毒物的LC50；Ai、Bi和Ci分別為A、B和C毒物單獨作用時的LC50。

將S轉換成相加指數(additive index, AI)。當S≤1時，AI=(1/S)-1.0；當S>1時，AI=1.0-S。當AI=0時為相加作用；當AI>0時為大于相加作用，即協同作用；當AI<0時為小于相加作用，即拮抗作用。

2 結果(Results)

2.1 單一農藥對斑馬魚仔魚的毒性效應

表1列出了單一農藥氯氰菊酯、殺螟硫磷、馬拉硫磷和咪鮮胺對斑馬魚仔魚的LC50值。在染毒24、48、72和96 h時，4種農藥對仔魚的致死作用都存在一定的時間-劑量效應關系，并且每種農藥的LC50值隨著暴露時間的延長呈逐漸降低的趨勢。氯氰菊酯對斑馬魚仔魚的毒性最高，屬于高等毒性，其96 h-LC50值為0.12 mg·L-1。馬拉硫磷對斑馬魚仔魚的毒性最低，屬于低等毒性，其96 h-LC50值為17.88 mg·L-1。在96 h時，氯氰菊酯對斑馬魚仔魚的毒性是馬拉硫磷毒性的149倍。各污染物對斑馬魚仔魚毒性次序為氯氰菊酯>咪鮮胺>殺螟硫磷>馬拉硫磷。

2.2 二元及多元農藥混合污染對斑馬魚仔魚毒性效應

氯氰菊酯、殺螟硫磷、馬拉硫磷和咪鮮胺的二元及多元混合污染聯合毒性效應如表2～表7所示。根據單一農藥對斑馬魚仔魚96 h-LC50的值，采用等毒性配比(1∶1)研究了二元、三元和多元農藥復合污染對斑馬魚仔魚的聯合毒性效應。在染毒24、48、72和96 h時，二元農藥混合污染(氯氰菊酯+馬拉硫磷；氯氰菊酯+殺螟硫磷和氯氰菊酯+咪鮮胺)對斑馬魚仔魚的聯合毒性均表現為協同作用。氯氰菊酯+馬拉硫磷二元聯合暴露對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為3.10、2.13、2.09和1.96，然而隨著暴露時間的延長這種協同作用逐漸減弱。

殺螟硫磷+咪鮮胺二元農藥混合污染對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為0.89、1.13、1.86和2.03，聯合毒性作用表現為協同作用，并且隨著暴露時間的延長協同作用增強。殺螟硫磷+馬拉硫磷對斑馬魚仔魚的二元聯合暴露在24、48、72和96 h的相加指數分別為0.27、0.06、0.05和0.12，這2種農藥的聯合暴露對斑馬魚仔魚在24 h的聯合毒性表現為協同作用，在48、72和96 h時聯合毒性表現為相加作用。馬拉硫磷+咪鮮胺二元農藥對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為-1.19、-1.38、-1.86和-1.14，聯合毒性作用表現為拮抗作用。

表2 氯氰菊酯、馬拉硫磷和殺螟硫磷對斑馬魚仔魚聯合毒性Table 2 The joint toxicity of cypermethrin, malathion and fenitrothion to zebrafish larvae

表3 氯氰菊酯、咪鮮胺和馬拉硫磷對斑馬魚仔魚聯合毒性Table 3 The joint toxicity of cypermethrin, prochloraz and malathion to zebrafish larvae

表4 馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺對斑馬魚仔魚聯合毒性Table 4 The joint toxicity of malathion, fenitrothion and prochloraz to zebrafish larvae

表5 氯氰菊酯、馬拉硫磷、殺螟硫磷和咪鮮胺混合污染對斑馬魚仔魚聯合毒性Table 5 The joint toxicity of cypermethrin, malathion, fenitrothion and prochloraz to zebrafish larvae

表6 馬拉硫磷、殺螟硫磷、咪鮮胺和氯氰菊酯混合污染對斑馬魚仔魚聯合毒性Table 6 The joint toxicity of malathion, fenitrothion, pochloraz and cypermethrin to zebrafish larvae

表7 四元農藥混合污染對斑馬魚仔魚聯合毒性Table 7 The joint toxicity of quaternary pesticide to zebrafish larvae

三元農藥氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為6.52、3.69、5.54和4.71，聯合毒性表現為協同作用；氯氰菊酯+馬拉硫磷+咪鮮胺對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為4.56、3.35、2.85和2.33，聯合毒性表現為協同作用，隨著暴露時間的延長這種協同作用逐漸減弱。馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為2.57、2.45、2.23和2.03，聯合毒性表現為協同作用，隨著暴露時間的延長這種協同作用逐漸減弱。咪鮮胺+氯氰菊酯+殺螟硫磷對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的聯合毒性相加指數分別為3.17、4.26、6.14和2.84，聯合毒性表現為協同作用。氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺四元農藥復合污染對斑馬魚仔魚在24、48、72和96 h的相加指數分別為3.55、3.76、3.55和3.35，聯合毒性均表現為協同作用。

3 討論(Discussion)

斑馬魚的不同生命階段(胚胎、仔魚、幼魚和成魚)均可以用來開展毒理學研究，但斑馬魚早期生命階段(胚胎和仔魚)對污染物的敏感性要高于其他生命階段(成年和幼魚)[22]。本研究中，斑馬魚仔魚在染毒24、48、72和96 h時，各污染物對斑馬魚毒性次序為氯氰菊酯>咪鮮胺>殺螟硫磷>馬拉硫磷。Bradbury和Coats[23]報道了在相同濃度下，擬除蟲菊酯類農藥對魚的毒性是對哺乳動物和鳥類的約1 000倍。擬除蟲菊酯類農藥氯氰菊酯對魚類具有高毒性，一方面是由于魚鰓對農藥有較高的吸收率和緩慢的水解率，另一方面是魚的神經系統對這些農藥有超敏感性[24]。

在真實的生態環境中，農藥污染物并不是以單體的形式存在，而是以混合污染物形式共同存在，較多的研究主要集中在單一污染物毒理效應方面[25]。采用單一污染物進行的毒性研究可能低估在復雜的混合污染環境中的毒性效應，混合污染物可能產生復雜的聯合毒性效應[26]。在本研究中，氯氰菊酯和有機磷類農藥復合污染(氯氰菊酯+馬拉硫磷、氯氰菊酯+殺螟硫磷)比其他幾種二元農藥的聯合作用表現出更強烈的協同作用，可能是由于有機磷類農藥和擬除蟲菊酯類農藥混合共存時，有機磷類農藥能與單加氧酶結合，導致分子的活化通過與單加氧酶結合，防止了擬除蟲菊酯類農藥的降解。二元農藥混合污染(氯氰菊酯+殺螟硫磷、氯氰菊酯+馬拉硫磷、氯氰菊酯+咪鮮胺和殺螟硫磷+咪鮮胺)對斑馬魚仔魚聯合作用也均表現為協同作用。在水生態系統中這些污染物共同存在時，污染物對水生生物的毒性效應可能增加。Liu等[27]開展了西草凈、除草定、環嗪酮、多果定、甲霜靈和殘殺威等6種農藥的二元復合污染對小球藻和發光細菌的毒性研究，采用濃度相加(CA)模型作為參考模型，8種二元農藥混合污染對發光細菌聯合作用表現協同作用，4種二元農藥混合污染對小球藻聯合作用表現為拮抗作用。也有研究表明，滅多威和辛硫磷對羅非魚的聯合毒性作用表現為協同作用[28]。

在筆者的研究中，所有三元農藥(氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷、氯氰菊酯+馬拉硫磷+咪鮮胺、馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺和咪鮮胺+氯氰菊酯+殺螟硫磷)和四元農藥(氯氰菊酯+馬拉硫磷+殺螟硫磷+咪鮮胺)混合污染對斑馬魚仔魚聯合作用均表現為協同作用。Wang等[29]研究了氯氟氰菊酯、毒死蜱和辛硫磷3種殺蟲劑和乙草胺的多元混合污染對陸棲生物蚯蚓的聯合毒性，結果表明，大多數三元和四元農藥混合暴露對蚯蚓的聯合毒性作用均表現協同作用。在真實的生態環境中，農藥復合污染的聯合毒性作用不僅與污染物的組成和濃度有關，還與測試系統和染毒時間等多種因素有關，可以說是一個很復雜的問題。當多種農藥殘留污染共同時，對水生生物可能產生復雜的聯合毒性效應，因此，未來研究中應更多關注混合污染物的生態毒理效應和風險評估。