背角無齒蚌AwPrx4A基因克隆及在PFOS和PFOA脅迫下的表達分析

夏西超，張科，宋國英，馬向莉，宗玉霞，張明霞，李冰潔，于瑞雪，薛士鵬，劉慶春，華春秀，張慶遠

1. 平頂山學院醫學院，平頂山 476000 2. 南陽醫學高等專科學校基礎醫學部，南陽 473061

全氟類化合物是一類以4～14個碳原子的烷基鏈為支架，氫原子被氟原子取代的具有高能C—F鍵的新型持久性有機污染物[1-2]。目前，全氟類化合物已被廣泛應用于粘合劑、農藥、阻燃劑、食品包裝盒、潤滑劑、藥品、油漆、拋光劑、制冷劑和表面活性劑的生產過程中[1-2]。日常生活中，大量全氟類化合物從廢棄物中釋放到自然界中，并隨降雨導致地表水和地下水的污染。研究表明，環境中較為常見的是全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)和全氟辛酸(perfluoroocanoic acid, PFOA)，已對水生生物生存造成威脅，給整個水生生態系統帶來潛在的壓力[3-4]。雙殼類軟體動物屬于濾食性動物，常年居住于固定環境，很少移動和遷徙，易于遭受水體重金屬和持久性有機染物的影響，使機體出現氧化應激反應，生成大量活性氧族(ROS)，給生物體造成脅迫[5]。生成過量的ROS能夠造成細胞電子傳遞鏈功能異常、線粒體出現呼吸爆發、生物大分子結構的破壞。為了減少ROS生成，降低脅迫效應，機體啟動抗氧化酶系統的表達[6]。在這些酶中，硫氧化蛋白過氧化物酶(peroxiredoxin, Prx)是重要成員之一，Prxs可以將過氧化氫、有機過氧化物和過氧化合物分別轉化為水、乙醇和亞硝酸鹽[7]。Prx屬于保守的抗氧化蛋白家族，抗氧化作用顯著，廣泛存在于原核生物和真核生物中。動物的Prx能夠發揮多種生物學功能，具有強大的抗氧化作用，在維持機體氧化還原平衡、細胞凋亡和增殖等方面發揮調節作用[7]。背角無齒蚌(Anodontawoodiana)是雙殼類軟體動物主要類群之一，已列入瀕危貝類物種，常作為淡水污染的指示性生物[8-9]。為了更好地保護淡水資源，對環境污染做出檢測，本研究從背角無齒蚌分離出AwPrx4A基因，分析PFOS和PFOA對其表達的影響，為揭示PFOS和PFOA脅迫效應奠定理論基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 背角無齒蚌處理

背角無齒蚌購自南陽市水產市場，PFOS(≥98%)、PFOA(96%)和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)購自Sigma-Aldrich公司，TRIzol試劑、M-MLV反轉錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產物回收純化試劑盒和RACE試劑盒均購自寶生物工程有限公司。其余常規藥品均為進口或國產分析純。背角無齒蚌殼長(6.5±0.5) cm，在暴露實驗之前，動物置于實驗室自動水循環系統中適應養殖2周，室溫20～25 ℃，相對濕度50%～60%，每次換水后投喂商品飼料。

半致死濃度(LC50)測定實驗的濃度梯度取值采用等差或等比方法，并結合預實驗結果進行設置，每個污染物設置5個濃度處理組，每組3個平行樣，每個平行10只動物，以正常飼養組為空白對照組，進行48 h急性毒性實驗，每12小時觀察并記錄背角無齒蚌的死亡率，死亡標準以動物外套膜松弛，長時開口，用玻璃棒輕觸外套膜緣5 min內無反應，及時撈出死亡個體并予以計數。

為了確定AwPrx4A組織分布，對來自同一塑料盒的6只動物進行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟、血淋巴和外套膜等組織。PFOS和PFOA溶解于DMSO中以制備儲備液。動物處理實驗在長方形塑料盒(40 cm×25 cm，高10 cm)中進行，飼養采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)[10]。動物分為對照組、PFOS處理組(6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1)和PFOA處理組(50、100、200、400和800 mg·L-1)，對照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過3‰。分別在0、6、12、24和48 h時每組取出6只河蚌，解剖肝胰臟、鰓和血淋巴，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 背角無齒蚌AwPrx4A全長cDNA擴增

總RNA提取采用TRIzol試劑，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，將具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，用M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應模板。引物AwPrx4A1和AwPrx4A2參考三角帆蚌、褶紋冠蚌、長牡蠣和爪蟾等物種的基因序列并采用DNAMAN軟件予以設計，合成后分離AwPrx4AcDNA保守區域片段，PCR產物連接至pMDT-19載體，雙向測序。確定AwPrx4A部分cDNA序列后，根據部分cDNA序列設計的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，擴增AwPrx4AcDNA的5’和3’區域序列，對5’RACE和3’RACE的PCR產物進行測序和拼接。

1.3 序列和系統發育分析

分析AwPrx4A序列，通過GenBank數據庫搜索(www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)進行BLAST程序比對；根據http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP上所載信息預測信號肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白質結構域；使用DANMEN分析程序對AwPrx4A基因進行多序列比對；通過Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org/)預測AwPrx4A的蛋白質三維結構；使用MEGA5.0軟件中的鄰接法構建系統進化樹。

1.4 AwPrx4A mRNA水平定量檢測

為了確定AwPrx4A轉錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒(寶生物工程有限公司)按照要求進行定量分析。根據AwPrx4AF和AwPrx4AR引物序列，使用普通PCR儀分離靶基因(表1)，擴增AwPrx4A基因片段長度為180 bp，瓊脂糖凝膠電泳僅在檢測出的一個條帶上進行PCR產物測序和序列鑒別。β-actin作為內參基因，使用ABI7500實時檢測系統(Applied Biosystems，美國)進行real-time PCR測定；反應條件為：95 ℃、30 s，1個循環；95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，40個循環；擴增效率為96.84%；構建標準曲線，通過2-△△CT分析AwPrx4A表達水平。

表1 實時定量PCR的引物序列Table 1 Primer sequences used in quantitative real-time PCR

1.5 LC50數據分析

LC50=lg-1[Xm-i×(∑D-0.5)]

式中：LC50為半數致死濃度(μg·L-1)，Xm為污染物最大濃度的對數值，i為相鄰2組污染物濃度對數的差值，D為各組背角無齒蚌死亡率(%)。

1.6 統計學處理

2 結果(Results)

2.1 背角無齒蚌AwPrx4A分子結構

背角無齒蚌AwPrx4AcDNA全長由958個核苷酸組成，包含1個120 bp的5’非編碼區，1個412 bp的3’非編碼區和1個426 bp的開放閱讀框(圖1)。開放閱讀框為由142個氨基酸組成的多肽鏈，分子量為16.87 kDa，等電點為4.97。SMART結果顯示，AwPrx4A包含還原酶結構域(定位在5～155 aa)、烷基脫氫過氧化物還原酶亞基C、巰基特異性抗氧化結構域(AhpC-TSA)(定位在6～139 aa)和C端硫氧化蛋白結構域(定位在159～194 aa)(圖1)。

AwPrx4A推導的氨基酸序列中沒有發現信號肽序列，包括Cys38、Cys48和Cys79共3個半胱氨酸殘基，第1個半胱氨酸殘基(IRFGHDWDPTCM)和第3個半胱氨酸(YLVDITEVPDFNKMYELYDPCT)在所有Prx4A序列中高度保守(圖2)。

AwPrx4A蛋白質的二級結構包含5個α-螺旋和6個β-折疊(圖3(a))。AwPrx4A的3-D結構與Prx4A家族成員高度相似(圖3(b))。

圖1 背角無齒蚌AwPrx4A基因的cDNA序列和推導的氨基酸序列注：起始和終止密碼用粗體表示，終止信號“AATAAA”以波浪線顯示，半胱氨酸保守氨基酸以方框表示。Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of AwPrx4A gene in Anodonta woodianaNote: The start and stop codons are indicated with bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the cysteime conserved domains is marked with box.

圖2 背角無齒蚌AwPrx4A與其他物種Prx4A序列多重比對注：半胱氨酸保守氨基酸殘基用下劃線表示。Fig. 2 Multiple alignment of AwPrx4A in Anodonta woodiana with other Prx4ANote: The conserved residues of cysteine are marked with underline.

圖3 背角無齒蚌AwPrx4A二級和3D結構預測注：(a). AwPrx4A二級結構；(b). AwPrx4A的3D結構。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwPrx4A deduced amino acids in Anodonta woodianaNote: (a). The secondary structure of AwPrx4A; (b). The 3D structure of AwPrx4A.

2.2 背角無齒蚌AwPrx4A進化關系

BLAST比對結果顯示，AwPrx4A與其他物種Prx4A成員關系密切，Prx4A與雙臍螺(Biomphalariaglabrata)同源性為94.39%，與黑指紋海兔(Aplysiadactylomela)同源性為93.67%，與長牡蠣(Crassostreagigas)同源性為92.63%，與非洲爪蟾(Xenopuslaevis)同源性為90.51%，與旋毛蟲(Trichinellanelsoni)同源性為86.43%。為了進一步分析Prx4A其他Prx序列之間的進化關系，用MEGA5.0系統進化樹，包括1-Cys、2-Cys和非典型2-Cys的Prxs。Prx1、Prx2、Prx3和Prx4群集于一個主類群中，構成2-Cys類群。所有Prx6都聚集在一起，組成了一個類群。所有Prx5都形成了非典型的2-Cys子群。Prx4As聚集在一起形成一個獨立類群，與非典型2-Cys類群關系相對密切。在Prx4A類群中，AwPrx4A與軟體動物包括海兔和雙肚臍螺的親緣關系最近，與人和其他物種親緣關系相對較遠(圖4)。

圖4 根據背角無齒蚌AwPrx4A氨基酸序列使用鄰接法構建的系統進化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of amino acid sequence of AwPrx4A between Anodonta woodiana and other organisms

2.3 背角無齒蚌AwPrx4A組織分布

Real-time PCR結果顯示，AwPrx4A在背角無齒蚌有廣泛的組織分布，包括斧足、外套膜、閉殼肌、心臟、肝細胞、血淋巴和鰓。AwPrx4A在肝胰腺中有較高的表達水平，在鰓、血淋巴、心臟和斧足為中等水平表達，在外套膜和閉殼肌表達水平相對較低(圖5)。

2.4 PFOS和PFOA的毒性效應濃度

急性毒性試驗結果表明，PFOS和PFOA對背角無齒蚌的LC50分別為28.388和192.083 mg·L-1(表2)。

2.5 PFOS和PFOA對背角無齒蚌肝胰腺AwPrx4A表達的影響

在濃度為6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中，肝胰腺中AwPrx4AmRNA水平的上調效應呈現時間和劑量依賴模式；與對照組相比，整個實驗觀察過程中，AwPrx4AmRNA水平在6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中分別增加了18.75%、2.85倍(P<0.05)、5.08倍(P<0.01)和5.52倍(P<0.01)以上(圖6)；與對照組相比，在100 mg·L-1的PFOS處理組，整個實驗觀察過程中肝胰腺AwPrx4AmRNA水平增加了6.77倍以上(P<0.01)(圖6(a))。

圖5 背角無齒蚌AwPrx4A基因的空間表達注：每組數據來源于6只動物，重復3次。Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwPrx4A transcript levels from different tissues of Anodonta woodianaNote: The data are obtained from 6 animals, 3 replicates in each group.

與對照組相比，在50、100、200和400 mg·L-1的PFOA處理組中，AwPrx4AmRNA水平分別增加了20.83%、2.21倍(P<0.01)、2.25倍(P<0.01)和3.19倍(P<0.01)。在800 mg·L-1的PFOA處理組中，AwPrx4A的mRNA水平增加了5.64倍以上(P<0.01)(圖6(b))。

2.6 PFOS和PFOA對背角無齒蚌鰓AwPrx4A表達的影響

與對照組相比，整個實驗觀察過程中，背角無齒蚌鰓中AwPrx4AmRNA水平顯著增高。在濃度6.25、12.5、25、50和100 mg·L-1的PFOS處理組中，鰓中AwPrx4AmRNA水平分別增加了61.61%(P<0.05)、86.86%(P<0.05)、2.25倍(P<0.05)、2.75倍(P<0.01)和3.04倍(P<0.01)以上(圖7(a))。

與對照組相比，整個實驗觀察過程中背角無齒蚌鰓中AwPrx4AmRNA水平顯著增高。在濃度50、100、200、400和800 mg·L-1的PFOA處理組中，鰓中AwPrx4AmRNA水平分別增加了59.59%(P<0.05)、91.91%(P<0.05)、1.56倍(P<0.05)、2.62倍(P<0.01)和3.45倍(P<0.01)以上(圖7(b))。

2.7 PFOA和PFOA對背角無齒蚌血淋巴AwPrx4A表達的影響

與對照組相比，整個實驗觀察過程中背角無齒蚌血淋巴中AwPrx4AmRNA水平顯示上調趨勢。在濃度6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平隨呈時間和劑量依賴性增高趨勢。在濃度6.25、12.5、25和50 mg·L-1的PFOS處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分別增加了47.42%、67.01%(P<0.05)、1.44倍(P<0.05)和2.43倍(P<0.01)以上。與對照組相比，在濃度為100 mg·L-1的PFOS處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平增加了2.67倍以上(P<0.01)(圖8(a))。

圖6 PFOS和PFOA對背角無齒蚌肝胰腺AwPrx4A基因表達的影響注：n=6/組/時間點；a、b表示與相應對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 6 Temporal expression of AwPrx4A gene in hepatopancreas of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

表2 全氟辛烷磺酸(PFOS)和全氟辛酸(PFOA)對背角無齒蚌的48 h-LC50Table 2 48 h-LC50 values of perfluorooctane sulfonate (PFOS) and perfluoroocanoic acid (PFOA) to Anodonta woodiana

圖7 PFOS和PFOA對背角無齒蚌鰓AwPrx4A基因表達的影響注：n=6/組/時間點；a、b表示與相應對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 7 Temporal expression of AwPrx4A gene in gill of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

圖8 PFOS和PFOA對背角無齒蚌血淋巴AwPrx4A基因表達的影響注：n=6/組/時間點；a、b表示與相應對照組相比有顯著差異(P<0.05、P<0.01)。Fig. 8 Temporal expression of AwPrx4A gene in hemocytes of Anodonta woodiana after PFOS and PFOA exposureNote: Data are expressed as means±SE; n=6/each group/each time point; a, b mean significant differences compared with the control at the same time (P<0.05, P<0.01).

與對照組相比，整個實驗觀察過程中背角無齒蚌血淋巴中AwPrx4AmRNA水平顯著增高。在濃度50、100和200 mg·L-1的PFOA處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平呈時間和劑量依賴性增高趨勢。在濃度50、100和200 mg·L-1的PFOA處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分別增加了20.61%、62.88%(P<0.05)和1.64倍(P<0.05)以上(圖8(b))。與對照組相比，在濃度為400和800 mg·L-1的PFOA處理組中，血淋巴中AwPrx4AmRNA水平分別增加了1.97倍(P<0.01)和2.14倍(P<0.01)以上(圖8(b))。

3 討論(Discussion)

研究表明，AwPrx4A的3個半胱氨酸殘基分別位于蛋白序列38、48和79處，第1個和第3個半胱氨酸殘基分別位于2個保守結構域IRFGHDWDPTCM和YLVDITEVPDFNKMYELYDPCT中，提示AwPrx4A可能屬于2-Cys Prx類群成員。根據硫氧化蛋白過氧化物酶順序、結構和功能特征，Prxs可分為3個主要類群：1-Cys、典型2-Cys和非典型2-Cys[11-12]。典型2-Cys型Prx由高度保守的2個半胱氨酸殘基組成，并形成二硫鍵，AwPrx4A中保守半胱氨酸殘基位置與典型2-Cys Prxs半胱氨酸所在位置高度重合[13-14]。研究證實，位于多肽鏈序列第1個半胱氨酸殘基與Prxs過氧化物酶活性有關，接受來自Arg128的氫鍵并將其提供給Glu55羧基。在3個半胱氨酸殘基中，第1個半胱氨酸殘基和第3個半胱氨酸殘基主要參與Prxs結構中的二硫鍵形成，這是氧化反應中間產物[15]。BLAST同源分析表明，AwPrx4A推導出的氨基酸序列與其他軟體動物的Prx4A有超過50%的相似之處。系統發育分析顯示，AwPrx4A和Prx4A早期分化，具有明顯的獨立性，提示Prx4A可能是Prxs的一個新家族，需要在未來闡明其進化特點和功能特性。

AwPrx4A在背角無齒蚌閉殼肌、肝胰腺、鰓、血淋巴、心臟和外套膜等中具有廣泛表達和分布，而且還分別表現出了特定表達譜和組織結構特異性。廣泛組織分布與AwPrx4A在組織中保持細胞的氧化還原平衡有關。結果顯示，鰓中AwPrx4A表達水平最高，作為水生生物的呼吸器官，鰓能夠從水中獲取氧；鰓暴露在外部環境中，與環境中重金屬、有機污染物和病原微生物等直接接觸，是環境因子脅迫效應的首要門戶，也是機體重要的免疫器官[16]。在選擇組織中，在肝胰腺和血淋巴中觀察到AwPrx4A有較高水平表達，這與肝胰腺和血淋巴作用有關；背角無齒蚌等軟體動物依靠先天免疫實現環境耐受性，在此過程中，肝胰腺和血淋巴在參與集體氧化應激和免疫耐受方面發揮關鍵的作用。同時肝胰腺作為重要代謝器官，不斷地分解和合成各種營養物質及有毒有害物質，細胞容易在代謝過程中遭受氧化應激效應，肝胰腺是對氧化應激的關鍵防線[17]。

本研究結果顯示，PFOS和PFOA對背角無齒蚌的LC50分別是28.388和192.083 mg·L-1，提示PFOS對背角無齒蚌環境毒性比PFOA更高。急性毒性實驗結果顯示，PFOS和PFOA對水蚤的48 h-LC50分別35和476 mg·L-1，這表明不同類型PFCs毒性差異可能與自身結構有關[1,18-19]。正常情況下，全氟類化合物對大多數生物標志物的細胞毒性效應通常會隨著氟原子數量增加而增強；對于同一處理濃度而言，毒性排序為PFOA(C7)

研究發現，PFOS和PFOA處理后背角無齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中AwPrx4A表達水平顯著增加，提示這可能與AwPrx4A可緩解機體氧化應激并提高脅迫耐受性有關。背角無齒蚌屬于底棲淡水濾食性生物，PFOS和PFOA很容易在動物進食過程中在細胞內累積下來，其中含有7個或更多氟原子的全氟化合物的累積過程會通過食物鏈呈現放大效應[20-21]。在ROS壓力環境下，較高ROS濃度可能會增加DNA損傷、脂質過氧化反應和蛋白質結構異常的風險。提高抗氧化酶的活性，有助于減少ROS的損傷[20-21]。Prxs是一種抗氧化酶，在消除氧化應激和增強免疫反應方面起著關鍵作用[20-21]。在中國對蝦中注射細菌后，動物血淋巴和肝胰腺中Prx4表達顯著提高用以減少ROS的生成和破壞[20]。在弧菌、白斑病病毒、過氧化氫和吲哚沙星等處理南美白對蝦后，Prx5表現水平顯著提高，增強其環境適應能力[22]。與正常組相比，布魯氏菌感染后綿羊卵巢中Prx6轉錄水平顯著升高，提高其病原耐受能力[23]。脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)處理后的小鼠體內，Prx1基因表達被明顯誘導；細菌、病毒和LPS處理的大鼠，Prx3表達水平顯著上調，用以增強動物免疫應答能力。環境污染物、高溫、聚肌胞(PolyI:C)、細菌和病毒處理水生生物大菱魚后，Prx6可以被各種壓力因素誘導上調。由此可見，Prx家族基因上調與提高環境耐受能力和脅迫能力密切相關，PFOS和PFOA處理對AwPrx4A的上調效應與背角無齒蚌對污染物脅迫抵抗能力的增強密切相關。

與脊椎動物相比，軟體動物免疫功能實現主要依靠先天免疫系統來完成。超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽-S-轉移酶和硫氧化蛋白過氧化物酶等一系列抗氧化酶在增強動物的免疫調控能力中發揮關鍵作用。在軟體動物中，維持機體穩態是一個復雜過程，需要肝胰腺、鰓和血淋巴等多個器官參與。PFOS和PFOA處理后，背角無齒蚌肝胰腺、鰓和血淋巴中AwPrx4A表達水平顯著增加，這有助于清除機體產生的過量ROS，提高細胞抗氧化能力，增強機體耐受性。