鄰苯二甲酸酯類增塑劑的體外細胞毒性評價

段晨暉，房彥軍，梁俊, 高志賢,#

1. 天津科技大學省部共建食品營養與安全國家重點實驗室, 天津 300457 2. 軍事科學院軍事醫學研究院環境醫學與作業醫學研究所, 天津市環境與食品安全風險監控技術重點實驗室, 天津 300050

增塑劑可以提高塑料產品的透明性、可塑性和柔韌性，被廣泛應用于塑料包裝的生產過程中[1]。近年來，增塑劑特別是鄰苯二甲酸酯類物質，引起了不少食品安全事件。鄰苯二甲酸酯(phthalate esters, PAEs)廣泛應用于塑料快餐盒、生鮮食品保鮮膜及食品容器中，造成食品的污染[2]。另外，這類物質非常容易散發到空氣中，難以降解，已成為全球性污染物。中國湖泊、江河中都普遍檢出了PAEs，最常見的是鄰苯二甲酸二正丁酯(dibutyl phthalate, DBP)和鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(bis(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)。DBP和DEHP是長江的主要污染物，濃度為35.65和54.73 μg·L-1，天津海河中也發現了最高濃度為41 μg·L-1的 DBP和101 μg·L-1的DEHP[3]。另外，在人體尿液和組織樣本中也檢測到了鄰苯二甲酸酯代謝物成分。Gao等[4]對中國新生兒母親群體進行了PAEs的累積暴露風險評估(CRA)，結果顯示，至少1.9%的新生兒母親的危險指數(HI)大于安全閾值，這說明PAEs在人群中存在潛在的不良影響。大量的研究表明，PAEs能夠干擾人類和動物一些激素調節的生理過程，改變內分泌和生殖系統的正常功能，是一種典型的環境內分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)[5]。另外，這類物質還具有一定程度的神經毒性、生殖發育毒性和潛在的致癌作用。最近的一些研究結果表明，低分子量的PAEs如DEHP和DBP毒性相對較強，而高分子量的PAEs如鄰苯二甲酸二異壬酯(diisononyl phthalate, DINP)毒性相對較弱[6]。REACH是歐盟關于化學品及其安全使用的法規，一些低分子量的PAEs如DBP、鄰苯二甲酸丁基芐酯(benzyl butyl phthalate, BBP)、DEHP和鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl phthalate, DIBP)在REACH中被歸類為非常危險的物質。在動物研究的基礎上，歐洲當局將它們歸類為1B類，即被認為對生殖有毒的物質[7]。表1總結了幾種常見的PAEs的暴露水平[8-13]。

針對人體尤其是嬰幼兒長期暴露于這些物質造成的健康風險，有必要對其毒理效應進行全方位的評估。PAEs毒理學效應研究的傳統方法主要是體內實驗，即傳統的整體動物毒性研究，雖然這種方法能夠為毒理學研究提供全面而豐富的數據和資料，但其所需的費用大、時間長，所得的毒性結果往往是繼發性的或最后的綜合損傷。由于傳統體內試驗的諸多不便之處，更具針對性的體外細胞毒性評價開始越來越多地應用在PAEs毒理學效應的研究中。近年來，體外細胞毒性評價由于其周期短、成本低和作用機制易于探明等優勢得到快速的發展[14]，成為PAEs毒理學研究的主流方法。與傳統的動物模型毒性評價相比，體外細胞毒性評價具有高通量、低成本、靈敏度高和重復性好等優點，適合針對特定作用位點進行快速初篩，減少了實驗動物的使用，提高了毒理學檢測的效率。本文從內分泌干擾毒性、生殖發育毒性、神經毒性、免疫毒性、遺傳毒性以及致癌作用幾個方面對PAEs的體外細胞毒性評價方法進行介紹，并簡略概述了其基本原理。

表1 幾種常見的鄰苯二甲酸酯(PAEs)代謝物在人體內的暴露水平Table 1 Exposure levels of several common phthalate esters (PAEs) metabolites in humans (ng·mL-1)

注：DEHP表示鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯，mMP表示鄰苯二甲酸單甲酯，mEP表示鄰苯二甲酸單乙酯，mBP表示鄰苯二甲酸單丁酯，miBP表示鄰苯二甲酸單異丁酯，mECPP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羧基戊基)酯，mCMHP表示鄰苯二甲酸單[(2-羧甲基)己基]酯，mEHHP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-羥基己基)酯，mEOHP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基-5-氧己基)酯，mEHP表示鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯，na表示數據不可得(尚未得到相關數據)。
Note: DEHP stands for bis(2-ethylhexyl) phthalate; mMP stands for monomethyl phthalate; mEP stands for monoethyl phthalate; mBP stands for monobutyl phthalate; miBP stands for mono-2-isobutyl phthalate; mECPP stands for mono(2-ethyl-5-carboxypentyl) phthalate; mCMHP stands for mono-[(2-carboxymethyl)hexyl] phthalate; mEHHP stands for mono(2-ethyl-5-hydroxyhexyl) phthalate; mEOHP stands for mono-(2-ethyl-5-oxohexyl) phthalate; mEHP stands for mono(2-ethylhexyl) phthalate; na stands for not available (data has not been obtained yet).

1 PAEs內分泌干擾毒性的體外檢測(In vitro evaluation of endocrine disrupting effects of PAEs)

目前，常用的PAEs內分泌干擾效應體外檢測方法主要有2類：一類是核受體介導的報告基因方法，主要用來檢測目標化合物對與內分泌功能相關的一些核受體的干擾作用；另一類是檢測目標化合物對一些特定細胞激素合成、分泌、轉運和代謝的影響。這2類測試方法的作用原理和途徑各不相同，具有其各自的優勢和應用范圍。

1.1 核受體介導的報告基因方法

類固醇激素(包括雌激素、雄激素和孕激素等)，可直接進入細胞內與相應受體結合成復合物，并轉移至細胞核內激活靶基因的轉錄，完成一系列復雜的生物學功能。這些受體是一類極其重要的轉錄調節因子，稱為核受體超家族(nucleic receptor superfamily)[15]。雌激素受體(estrogen receptor, ER)、雄激素受體(androgen receptor, AR)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptor, TR)和維甲酸受體(retinoic acid receptor, RAR) 都是重要的轉錄調節因子，可與激素或配體結合后轉移到細胞核內，激活靶基因轉錄并發揮調節作用，與生殖過程、新陳代謝調節和分化發育密切相關。

Engel等[16]運用穩定轉染的細胞系ERα-HEK和ERβ-HEK進行了熒光素酶報告基因測定(luciferase reporter gene assay)，檢測了一些PAEs及其主要和次要代謝物對人類ERα或ERβ活性的影響。實驗結果表明，除了BBP以外的其他PAEs及其代謝產物均未增強ERα和ERβ的活性；而大部分PAEs對ERα和ERβ的活性具有抑制作用。Ghisari和Bonefeld-Jorgensen[17]使用MVLN反式激活報告基因法測定了幾種PAEs對ER的誘導作用，在該測定中，只有BBP和DBP微弱增強了ER的活性，DEHP、鄰苯二甲酸二乙酯(diethyl phthalate, DEP)未引起ER介導的反應。沈歐璽[18]運用核受體介導的報告基因試驗方法(也稱為轉錄激活試驗)，研究了2種鄰苯二甲酸酯類增塑劑及其代謝物包括DEHP、DBP和鄰苯二甲酸單丁酯(monobutyl phthalate, MBP)對ER、AR和TR的干擾作用。研究結果表明，這3種物質均具有抗雄激素活性和抗甲狀腺激素活性，無擬雌激素活性。Czernych等[19]使用雙酵母雜交技術(XenoScreen YES/YAS)研究了幾種PAEs的雌激素和雄激素活性，發現一些PAEs在較低的濃度范圍內表現出較強的抗雌激素和抗雄激素效應。

這類核受體介導的報告基因檢測方法普遍具有高通量、低成本和靈敏度高等優勢，但其局限性在于只能用來評價環境內分泌干擾物對核受體的干擾作用。內分泌系統是一個復雜精密的系統，環境污染物不僅可以通過影響天然激素與受體結合的受體介導途徑發生作用，還可通過干擾激素合成、分泌、轉運和代謝等非受體介導途徑干擾內分泌系統的正常運作[20]。

1.2 非受體介導途徑的體外細胞模型

為了檢測一些環境污染物非受體介導途徑的內分泌系統干擾作用，各種具備不同功能和特點的細胞模型也陸續被開發出來。

激素應答小鼠睪丸間質腫瘤細胞系(Hormone-responsive mouse Leydig MA-10 tumor cell line)是一種有效的激素應答細胞模型，這種細胞能夠在人絨毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotropin, hCG)的作用下誘導孕酮的生成。Boisvert等[21]測試了DEHP的代謝產物鄰苯二甲酸單(2-乙基己基)酯(mono(2-ethylhexyl) phthalate, MEHP)對MA-10細胞中孕酮合成的影響，結果顯示，濃度為10-4mol·L-1的MEHP顯著抑制了MA-10細胞孕酮的生成。H295R細胞系源于人腎上腺皮質瘤，能表達類固醇激素合成過程中涉及的所有酶類，具有類似未分化的胚胎腎上腺細胞的生理特性，能生成腎上腺皮質合成的所有類固醇激素，如孕激素、雄激素、雌激素、糖皮質激素和鹽皮質激素等，并與正常的人腎上腺細胞對毒物的反應水平一致[22]，因此，H295R 細胞系成為體外篩選環境類固醇激素干擾物和研究其機制的最具潛力的工具。Harvey 等[23]指出 H295R 細胞系是一種有效的體外篩選環境類固醇激素干擾物的細胞模型。葉婷等[24]研究了DEHP及其代謝產物MEHP對H295R 細胞類固醇激素合成有關的關鍵基因表達的影響，實驗結果表明，DEHP、MEHP均可影響H295R細胞類固醇激素合成過程中關鍵基因的表達，并且MEHP 的影響更加明顯。Mankidy等[25]通過H295R類固醇生成實驗，發現暴露于10 mg·L-1的DEHP導致培養基內的雌二醇(E2)濃度增加4倍；暴露于10 mg·L-1的DEP導致培養基內的E2濃度增加2.3倍。除此之外，人胎盤絨毛膜癌(JEG-3)細胞系也是一種很有效的細胞模型，這種細胞能夠表達在發現于胎盤中的特定類固醇生成酶中，并具有非常高的芳香酶活性[26]。由CYP19編碼的胎盤芳香酶催化雄激素芳構化為雌激素，它是雌激素生物合成中的關鍵酶，也是內分泌干擾物靶向的關鍵終點[27]，這對于母體懷孕期間的健康非常重要。Perez-Albaladejo等[28]研究了一些PAEs對JEG-3細胞系P450芳香酶活性的影響，實驗結果表明, BBP和DBP顯著降低了P450芳香酶的活性(IC50值大致為14 ～15 μmol·L-1)。綜上所述，一些PAEs在人和動物體內所造成的內分泌干擾效應很有可能是通過干擾激素合成的途徑引起的。

2 PAEs胚胎發育毒性的體外檢測(In vitro detection of embryonic developmental toxicity of PAEs)

大量動物研究表明，DEHP具有胚胎毒性，影響胚胎、胎兒發育。近20年來，隨著干細胞研究的日臻成熟，胚胎干細胞(embryonic stem cell, ESC)已成為發育毒性實驗的一種嶄新受試對象，能靈敏、準確地評價有害物質的毒性作用[29]。根據胚胎干細胞特性發展起來的胚胎干細胞模型，可用于評價環境內分泌干擾物潛在的胚胎毒性和致畸性。

崔棟等[30]建立了小鼠胚胎干細胞試驗模型，對DEHP的胚胎毒性進行了評價，研究結果表明，DEHP為弱胚胎毒性化合物。Yin等[31]使用小鼠胚胎干細胞評估了DEP和DBP的早期發育神經毒性。實驗結果表明，在濃度約為10 μmol·L-1時，DEP和DBP可以顯著改變神經外胚層與神經祖細胞形成過程中關鍵基因的表達，這表明DEP與DBP具有潛在的神經發育毒性。李玉秋等[32]分析了不同濃度的DEHP及其代謝產物MEHP對小鼠胚胎干細胞活力與增殖的影響，研究發現隨著染毒劑量的增加(0.01～1 000 μmol·L-1)，DEHP、MEHP 對小鼠 ESC 活性的抑制作用增強，且存在明顯的劑量-效應關系，高劑量(1 000 μmol·L-1)的DEHP和MEHP對小鼠胚胎干細胞的增殖具有明顯的抑制作用。

綜上所述，經過許多研究者的驗證，ESC已越來越多地應用于化學品胚胎發育毒性的預測。胚胎干細胞試驗(embryonic stem cell test, EST)使用小鼠或人的胚胎干細胞來評估化學物潛在的胚胎發育毒性，非常適合于胚胎毒性評估。目前EST已經被證明能夠在早期胚胎發育以及基因表達模式分化的時期指定細胞發育的流程[33]，從而得到不同功能的細胞類型，這種強大的分化潛力為化學物的毒理研究提供了豐富的實驗素材。

3 PAEs神經毒性的體外檢測(In vitro detection of neurotoxicity of PAEs)

近幾年，PAEs的神經毒性開始受到人們的關注。PAEs具有脂溶性，易通過胎盤及血腦屏障進入腦組織，影響神經系統的發育[34]。流行病學調查研究顯示，尿液中的DEHP代謝物MEHP的濃度可能與兒童的注意缺陷多動癥有關[35]。此外，有人發現胚胎期暴露于DEHP可損傷嚙齒動物的記憶行為，并認為可能與神經細胞內Ca2+濃度升高以及誘導神經細胞凋亡有關[36]。目前，對于PAEs神經毒性的體外評價主要是從待測細胞的氧化應激、細胞凋亡以及增殖分化這幾個方面進行。

PC 12 細胞來源于大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，因其在神經生長因子刺激培養下表現出的形態、結構和功能皆類似于神經細胞，因而在神經科學實驗研究中得到廣泛應用[37]。朱才眾等[38]研究了低劑量的DBP對PC12細胞的毒性效應，結果表明，不同劑量的DBP暴露對PC12細胞的增殖具有顯著的抑制作用，且在低劑量慢性暴露條件下引起了PC12細胞的凋亡。同時DBP暴露還顯著降低了PC12細胞的脂質過氧化物酶活性，造成了細胞的氧化應激損傷。Chen等[39]使用PC12細胞作為神經發育模型來研究MEHP暴露對神經元發育過程的影響，他們將未分化的PC12細胞暴露于MEHP中，研究其對細胞增殖和分化的影響。實驗結果表明，MEHP以劑量依賴性的方式抑制細胞增殖，并且促進了PC12細胞的膽堿能表型分化。這是MEHP通過影響細胞增殖和分化中的特定事件引發神經發育毒性的第一次證明。除了PC12細胞，小鼠神經瘤細胞也可作為研究神經毒性的模型細胞。閔安娜等[40]研究了BBP對小鼠神經瘤細胞的凋亡和氧化損傷水平的影響，研究發現，當BBP染毒濃度≥5 g·L-1時，存活細胞減少，并且細胞界限不清，開始出現凋亡小體，這說明高濃度的 BBP 可以抑制神經細胞的生長并造成神經細胞的凋亡；而對染毒后細胞的活性氧(ROS)水平、丙二醛(MDA)以及還原型谷胱甘肽(GSH)含量的測定結果則表明BBP的暴露可以引起神經瘤細胞的氧化損傷，從而進一步誘導了細胞的凋亡。

4 PAEs免疫毒性的體外檢測(In vitro detection of immunotoxicity of PAEs)

免疫毒性是指外源化學物通過損傷一些免疫細胞的形態和功能，干擾神經內分泌網絡，使得機體免疫功能低下；或是通過影響免疫細胞的抗原識別能力和敏感性，導致過度的免疫應答，從而引起超敏反應或自身免疫性疾病。有關PAEs的免疫毒性，特別是其對免疫細胞的作用和介導超敏反應的研究已經有了一些進展。Hoppin等[41]在美國全國范圍內調查了人群尿液中的PAEs代謝產物含量并調查了人群過敏癥狀，對相關數據進行了分析統計，結果顯示，DEHP和BBP的代謝產物能夠誘導與哮喘、花粉熱和關節炎等疾病密切相關的19種特異性抗體的產生，這說明，PAEs的接觸暴露與一些超敏反應及自身免疫性疾病的發病有關。Kruger等[42]研究發現，人角膜內皮細胞B4G12暴露于DEHP后，炎癥相關因子IL-1β、IL-8和IL-16的分泌增加，其基因表達水平也有所升高。韓佳縈等[43]研究了DEHP對巨噬細胞的免疫毒性作用，實驗中采用了不同劑量的DEHP處理小鼠巨噬細胞株RAW264.7細胞，通過檢測細胞活力、細胞吞噬能力、細胞因子分泌及活性氧水平的變化來評估DEHP暴露對免疫系統的毒性作用；實驗結果表明，高濃度的DEHP處理可造成RAW264.7細胞的急性損傷，抑制了其細胞吞噬能力和細胞因子(TNF-α、IL-12和IL-23)的分泌能力，并且造成細胞內的活性氧產生。以上研究均表明，PAEs的暴露可從多方面影響免疫應答，造成免疫毒性作用。

5 PAEs遺傳毒性的體外檢測(In vitro detection of genotoxicity of PAEs)

目前，已經有許多體內外的研究表明，PAEs暴露能夠造成染色體和DNA的損傷，引發遺傳毒性作用。單細胞凝膠電泳技術(single cell gel electrophoresis, SCGE)又稱彗星實驗，是一種廣泛應用于遺傳毒理學的技術，在檢測一些外源化學物對DNA的損傷方面有很高的靈敏性。Wang等[44]使用人胚胎腎細胞系(HEK-293)，通過單細胞凝膠電泳檢測了DEHP誘導的DNA鏈斷裂，并通過檢測細胞中GSH含量的變化評估了氧化應激在DNA損傷過程中的作用；實驗結果表明，DEHP能夠引起HEK-293細胞的DNA損傷，DEHP是通過氧化應激誘導DNA鏈斷裂的，研究還發現，溶酶體和線粒體可能是DEHP誘導DNA損傷的重要靶點。細胞分裂阻滯微核測定(cytokinesis-block micronucleus, CBMN)也是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種試驗方法。Molino等[45]運用了彗星試驗和微核測定2種方法評估了不同濃度的DEHP對歐洲鱸魚胚胎細胞系(DLEC)的遺傳毒性作用；彗星試驗的結果表明，DLEC細胞DNA鏈斷裂的總量隨著DEHP濃度的增加而顯著增加；微核測定的結果表明，DEHP染毒濃度的增加引起了DLEC細胞微核率的顯著上升。以上研究都充分證明了PAEs潛在的遺傳毒性作用。

6 PAEs致癌作用的體外檢測(In vitro detection of carcinogenesis of PAEs)

PAEs潛在的致癌作用也是近年來學者關注的重點。流行病學研究表明，PAEs暴露與人乳腺癌發病率呈正相關[46]。Crobeddu等[47]將乳腺癌上皮細胞T-47D暴露于接近環境劑量的DEHP和MEHP，實驗結果表明暴露于10 000 nmol·L-1的DEHP或0.1 nmol·L-1的MEHP可顯著促進T-47D細胞的增殖，而不會誘導細胞凋亡。該實驗還表明，DEHP和MEHP可以通過激活孕酮受體(progesterone receptor, PR)信號傳導促進乳腺癌上皮細胞的增殖，這可能增加乳腺癌發生的風險。Wu等[48]研究了BBP對ER(+)MCF-7乳腺癌細胞與ER(-)MDA-MB-231乳腺癌細胞增殖的誘導作用，實驗結果表明，BBP能夠顯著促進這2種乳腺癌細胞的增殖，并加速其細胞周期從G1期進展至S期。同時，該研究團隊還首次發現microRNA-19通過靶向PTEN 3’UTR(某種抑癌基因片段)，在BBP促進乳腺癌細胞增殖的過程中發揮了至關重要的作用。Zhu等[49]研究發現，低劑量的PAEs (DEHP、DBP和BBP)能夠促進PC-3和22RV1前列腺癌細胞的增殖，改變細胞周期相關基因的表達，并激活與癌癥細胞增殖密切相關的一些轉錄因子，這說明PAEs可能是前列腺癌的癌癥啟動子。

7 總結及展望(Summary and prospects)

隨著國內外學者對PAEs毒理作用研究的不斷深入，各種針對其內分泌干擾效應、生殖發育毒性、神經毒性、免疫毒性、遺傳毒性以及致癌作用的體外細胞毒性評價模型開始得到廣泛的應用(表2)。細胞毒性評價是從細胞類型的選擇、到評價指標的確定、進而選擇適合的檢測方法的過程。在這一過程中，需要根據所測試的毒性效應來選擇具有不同功能和特點的細胞模型，例如，在評價待測物的內分泌干擾效應時被廣泛應用的核受體介導的報告基因篩選細胞模型，用于胚胎發育毒性評價的ESC試驗模型，用于評價神經毒性作用的PC12細胞和神經瘤細胞模型，以及用于免疫毒性檢測的巨噬細胞模型等。體外細胞毒性評價具有周期短、成本低和機制易于探明等優點，細胞培養所需器材和原料的成本與動物養殖相比較低廉，且不像動物實驗那樣需要大量的人力投入，相對地易于操作和管理，節省人力物力。目前，PAEs體外細胞毒性評價的研究領域已經從細胞水平上升到基因水平，通過數字基因表達譜測序、熒光定量PCR(qRT-PCR)等分子生物學技術，能夠篩選出一些與細胞凋亡、增殖、代謝和分化等生理指標密切相關的差異表達的基因，進而揭示出PAEs不同毒性效應的作用機制。

PAEs在環境中的濃度很低，大多數在機體中通過不斷蓄積或者幾種化學物共同作用，對生殖、免疫和神經系統造成損害，嚴重影響機體健康[50]。而且PAEs是脂溶性物質，這些物質在環境中被動物和人體接觸暴露后，一旦進入體內，便很快積蓄到脂肪組織里，不宜排泄出去，這可能導致動物體內高濃度的PAEs殘留。由此可見，除了單一的體外細胞毒性研究，PAEs對人和動物整體毒性作用的研究也是非常必要的。體外細胞試驗模型在毒理學評價的過程中雖然具有各種顯著的優勢，但也有其不足之處。由于細胞毒性評價只是體外單細胞水平上做出的毒性評估，沒有生物整體水平上的驗證，缺乏生物體內各細胞、組織和系統之間的相互聯系，因此無法準確地得出PAEs在體內環境下經各系統作用后的整體毒性。因此，PAEs的體外毒性評價還需與體內實驗相結合，或是盡可能地模擬體內環境，增強實驗數據的準確性與可靠性。相信隨著新的技術和方法的不斷出現，以及國內外學者的共同努力，PAEs毒理學效應的研究將會邁向更高的水平。

表2 用于鄰苯二甲酸酯(PAEs)體外細胞毒性評價的細胞模型匯總Table 2 Summary of cell models for in vitro cytotoxicity evaluation of phthalate esters (PAEs)