3種止痢型中獸藥液體制劑中非法添加黏菌素的HPLC-PDA檢查方法的建立

韓寧寧 ， 劉 暢 ， 于曉輝 ， 范 強 ， 趙 暉 ， 董玲玲 ， 楊秀玉 ， 萬仁玲

(1.中國獸醫藥品監察所 ， 北京 海淀 100081；2.華南農業大學 ， 廣東 廣州 510642)

黏菌素，又稱多黏菌素，是從多黏桿菌培養液中分離出的一種多組分的多肽類抗生素。由于黏菌素對革蘭陰性桿菌(大腸埃希菌等)引起的腸道感染具有良好的治療效果，有不法中獸藥制劑生產企業將其添加于用于止痢的口服液或注射液中，以增強療效。該處方外非法添加行為嚴重擾亂了獸藥市場秩序，影響了畜產品質量安全，應予以制止與懲戒。但由于黏菌素在《中國獸藥典》中含量測定方法為效價法，目前仍沒有針對止痢型中獸藥液體制劑中非法添加黏菌素的檢查方法。本研究旨在建立一種簡便準確的高效液相色譜法，以實現對止痢型中獸藥液體制劑中添加黏菌素進行定性定量檢測。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀，Waters2695，配二極管陣列檢測器2998(PDA)；電子天平AX205，梅特勒-托利多。

1.2 藥品

1.2.1 黏菌素對照品 批號/來源/含量：K0271305/中國獸醫藥品監察所/22782單位/mg。

1.2.2 空白止痢型中獸藥液體制劑 楊樹花口服液(來源/批號/規格：佛山市南海禪泰動物藥業有限公司/161003/1 mL相當于原生藥1 g)；板藍根注射液(來源/批號/規格：江西鑫維藥業有限公司/20151201/1 mL相當于原生藥0.5 g)；小檗堿注射液(來源/批號/規格：長沙拜特生物科技研究所有限公司/20151201/10 mL：0.1g)。

1.3 試劑 乙腈，色譜純，德國Merck公司；硫酸鈉、磷酸，分析純，國家集團化學試劑有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件 采用Waters HSS T3C18色譜柱，250×4.6 mm，5 μm。流動相為乙腈∶硫酸鈉磷酸水溶液(20∶80)，硫酸鈉磷酸水溶液∶硫酸鈉水溶液(7 g/L)：磷酸水溶液(6.8%)(50.5∶22.75)。采集波長200～400 nm，分辨率1.2 nm，提取波長215 nm。流速1.0 mL/min。進樣量20 μL。柱溫30 ℃。

2.2 溶液配制

2.2.1 制劑空白溶液 分別取楊樹花口服液、板藍根注射液、小檗堿注射液1 mL，置100 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.2.2 專屬性溶液 分別取楊樹花口服液、板藍根注射液、小檗堿注射液1 mL，置100 mL容量瓶中，分別加黏菌素標準品20 mg，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.2.3 檢出限溶液 將黏菌素標準品用水溶解配制為2 mg/mL的母液。取楊樹花口服液1 mL，置100 mL容量瓶中，加上述母液5 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得；取板藍根注射液1 mL，加上述母液 2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得；取小檗堿注射液1 mL，加上述母液2 mL，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

2.2.4 線性溶液 將黏菌素標準品用水溶解配制為2 mg/mL的母液，作為線性溶液⑤。分別取上述母液 1 mL、5 mL、5 mL、5 mL分別置50 mL、50 mL、25 mL、10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻得線性溶液①、②、③、④。

2.2.5 回收率溶液 取楊樹花口服液、板藍根注射液、小檗堿注射液各1 mL，分別置100 mL容量瓶中，加黏菌素標準品20 mg，加水稀釋至刻度，搖勻即得。進樣前用0.45 μm濾膜過濾。

3 結果

3.1 專屬性 板藍根注射液本底對黏菌素E1及E2色譜峰均無影響；楊樹花口服液及小檗堿注射液本底均有色譜峰與黏菌素E2重合，但對E1無影響。故選取黏菌素E1峰作為目標峰。黏菌素標準品溶液色譜圖及三種制劑空白溶液色譜圖見圖1～圖4。

圖1 黏菌素標準品色譜

圖2 板藍根注射液制劑空白溶液色譜

圖3 楊樹花口服液制劑空白溶液色譜

圖4 小檗堿注射液制劑空白溶液色譜

3.2 標準曲線及線性范圍 以峰面積為(y)為縱坐標，相應濃度(x)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=2.9E6x-20762，相關系數R2=0.9999，表明黏菌素E1在0.04～2 mg/mL濃度范圍內線性關系良好。

3.3 檢出限 將PDA光譜圖平滑無鋸齒狀波動，且純度角度大于純度閾值、PDA匹配角度大于PDA匹配閾值作為檢出限評定標準，得3種制劑檢出限分別為：板藍根注射液4 mg/mL、小檗堿注射液4 mg/mL、楊樹花口服液10 mg/mL。

3.4 回收率 3種止痢型中獸藥液體制劑中黏菌素的添加回收率為95.9%～97.9%，RSD為0.9%～1.8%，表明該方法回收率良好，準確度符合《中國獸藥典》獸藥質量標準分析方法驗證指導原則[3]的要求。見表1。

表1 3種止痢型中獸藥液體制劑中黏菌素E1添加回收率

4 討論與小結

4.1 止痢型中獸藥液體制劑的選擇 止痢型中獸藥液體制劑，除本方法建立中使用到的楊樹花口服液、板藍根注射液、小檗堿注射液外，還有雙黃連口服液、雙黃連注射液、金芩芍注射液等。但后3種制劑即便與微量黏菌素混合亦會產生絮狀沉淀，分析可能是黏菌素的酸性成分使制劑中的蛋白類成分發生變性所致。故后3種制劑不可能存在處方外非法添加黏菌素的可能，因而本研究選擇了上述前3種液體制劑作為供試品空白制劑。

4.2 色譜方法中流動相及檢測波長的選擇 本方法所選用的流動相系統參考了文獻[4]：乙腈∶硫酸鈉水溶液(7g/L)：磷酸水溶液(6.8%)(22.25∶50.5∶22.75)，并對該系統中有機相與水相的比例進行了細微調節，以使上述3種中獸藥制劑的本底色譜峰均可與黏菌素E1峰實現良好分離。另外，文獻[4]選取的提取波長為205 nm，雖然與215 nm比較，205 nm下黏菌素E1的紫外吸收強度更強，但中獸藥制劑的本底色譜峰干擾亦更強。為保證黏菌素E1與本底色譜峰的良好分離，選取干擾更低的215 nm作為提取波長。