新西蘭兔Keap1基因實時熒光定量PCR檢測方法的建立

胡 波 ， 范志宇 ， 魏后軍 ， 仇汝龍 ， 陳萌萌 ， 宋艷華 ， 朱偉峰 ， 徐為中 ， 王 芳

(江蘇省農業科學院獸醫研究所 農業部獸用生物制品工程技術重點實驗室 ， 江蘇 南京 210014)

Keap1-Nrf2-ARE是目前發現的最重要的抗氧化應激通路，其可調節各種內外環境引發的氧化應激，減少細胞受到的氧化損傷[1]。Keap1是Nrf2蛋白的主要抑制因子，被認為是氧化應激的感受器[2]，其與Nrf2蛋白的互作對抗氧化應激通路的調控具有重要作用[3-4]。病毒感染、炎癥等許多疾病的發生發展均與氧化應激密切相關[5-6]，但到目前為止，兔作為一種廣泛用于病理學、生理學及免疫學等研究的試驗動物，其抗氧化應激通路關鍵基因的表達水平仍缺乏相應的檢測手段，而Keap1、Nrf2等基因的表達水平反映了該通路的激活或抑制情況。此外，Keap1也是一種腫瘤抑制因子，其能結合并促進致癌酶IKK的泛素化降解，且Keap1基因的表達水平與病人死亡率直接相關[7]。本試驗以新西蘭兔為對象，建立了兔Keap1基因熒光定量PCR檢測方法，為研究兔Keap1基因的表達調控及在相關疾病中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和工具酶 RNAiso Plus、反轉錄試劑盒、TB Green Premix ExTaqⅡ、pMD-19T載體、T4 DNA連接酶、核酸凝膠回收試劑盒,購自TaKaRa公司；DEPC水,購自北京索萊寶科技有限公司；DH5α感受態細胞、DNA Marker DL-2 000、1.1×Pfu Master Mix,購自南京擎科生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 試驗動物及樣品采集 2月齡健康新西蘭母兔2只，購自金陵種兔場，耳靜脈空氣針處死后，分別采集心、肝、脾、肺、腎、腦等組織，置于-80 ℃保存。

1.3 引物設計 參照GenBank中穴兔Keap1基因序列(NO.XM008251548)，利用Primer 5.0軟件分別設計用于擴增Keap1基因C端的引物和檢測Keap1基因的特異性鑒定引物(表1)，由南京擎科生物科技有限公司合成。

表1 兔Keap1基因引物序列

1.4 RNA的提取及cDNA的合成 使用RNAiso Plus提取兔心、肝、脾、肺、腎、腦等組織懸液的總RNA，以反轉錄試劑盒進行cDNA的合成。反轉錄反應條件：37 ℃反應15 min，85 ℃反應5 s，4 ℃保存備用。

1.5 標準陽性質粒的制備 以Keap1C-F和Keap1C-R為上下游引物，通過PCR擴增、回收、連接及轉化，構建重組質粒pMD-19T-Keap1C。反應體系：cDNA 4 μL，Pfu Master Mix 44 μL，10 μM上、下游引物各1 μL，總體積50 μL。反應條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 5 min。1.0 %瓊脂糖凝膠電泳后，將目的片段回收、純化，并克隆入pMD-19T載體，轉化E.coliDH5α感受態細胞，過夜培養后挑取單菌落，送至南京擎科生物科技有限公司測序。

1.6 熒光定量PCR檢測方法的建立

1.6.1 標準曲線的建立 測定pMD-19T-Keap1C質粒濃度并10倍系列稀釋作為標準質粒模板，按羅氏480 PCR儀的反應體系和條件進行實時熒光定量PCR。反應體系：TB GreenTMPremix ExTaq10 μL，10 μM上、下游引物各0.8 μL，質粒模板 2 μL，加ddH2O至總體積20 μL。擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環。以模板拷貝數的對數為橫坐標，以Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.6.2 敏感性和重復性檢測 以10倍系列稀釋的標準質粒為模板分別進行實時定量PCR和普通PCR，檢驗方法的敏感性。將不同稀釋度的標準品進行重復檢測，計算組間和組內變異系數，分析方法的重復性。

1.7Keap1在兔組織中的含量檢測 以2只新西蘭兔不同組織提取的cDNA為模板，兔β-actin為內參基因，進行實時熒光定量PCR檢測，并采用2-ΔΔCt算法，計算Keap1在兔不同組織中的相對表達量。

2 結果

2.1Keap1基因擴增及陽性質粒的制備 以TRIzol法提取新西蘭兔肝臟的總RNA，并以反轉錄得到的cDNA為模板擴增Keap1基因C端。結果顯示，獲得大小約600 bp的特異性條帶(圖1)。經回收純化并連接pMD-19T載體后，挑取陽性菌落測序。經序列比對，所擴增的Keap1基因C端序列與GenBank上穴兔Keap1基因序列的同源性為100%，表明陽性質粒pMD-19T-Keap1C制備成功，經測定，質粒濃度為5.28×1011拷貝/μL。

2.2 標準曲線的繪制 將陽性質粒pMD-19T-Keap1C進行10倍系列稀釋，以不同濃度的質粒為標準品模板進行熒光定量PCR擴增，每個樣品稀釋度做3個重復試驗。結果表明，新西蘭兔Keap1基因標準曲線Ct值和標準質粒濃度間呈現良好的線性關系，y=-3.174x+39.69，R2=0.999 2(圖2)，擴增效率為103%。

圖2 新西蘭兔Keap1基因標準品的擴增曲線(A)和標準曲線(B)

2.3 敏感性檢驗 用建立的熒光定量PCR方法對10倍系列稀釋標準質粒進行檢測，結果顯示，實時熒光定量PCR方法的敏感性是普通PCR方法的1 000倍(圖3)。

圖3 新西蘭兔Keap1基因標準質粒熒光定量PCR(A)和普通PCR(B)檢測

2.4 重復性檢驗 將6個不同稀釋度標準質粒(5.28×109～5.28×104拷貝/μL)重復檢測3次，并于不同時間再分別檢測3次。經計算，組內變異系數CV為0.2%～1.1%，組間變異系數CV為1.3%～3.7%。

2.5Keap1基因在兔不同組織中的表達差異分析 用建立的實時熒光定量PCR方法對2月齡新西蘭兔各組織進行檢測。結果顯示，Keap1和β-actin的熔解曲線為單峰，特異性良好(圖4)。Keap1 mRNA在兔心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦中均可檢測到，且在肝臟中表達最高，在脾臟中表達最低。經GraphPad Prism 5軟件單因素方差分析，相對于Keap1基因在脾臟的表達水平，Keap1在心臟和腎臟的表達水平與脾臟之間存在顯著差異(P<0.05)，Keap1在肝臟、肺臟和腦的表達水平與脾臟之間存在極顯著差異(P<0.01)(圖5)。

3 討論

活性氧(ROS)自由基引發的氧化應激涉及到多種疾病的病理過程。Keap1是調控抗氧化應激通路中Nrf2活性的主要分子。當機體遭遇病毒感染、重金屬暴露等各種內外環境刺激后產生大量ROS，使Nrf2與Keap1解偶聯并入核，啟動下游靶基因的轉錄和表達[8-9]。研究發現，在砷引起中毒的研究中，砷暴露引起機體Keap1表達下調和Nrf2表達上調，從而影響機體的氧化應激水平[10]。在乳腺癌研究中，Keap1的表達上調促進了IKK的降解，提高了病人的存活率[7]。另外，Keap1-Nrf2-ARE和NF-κB這兩條細胞內重要的信號通路共同參與多個生物反應進程，它們之間相互關聯和影響。據報道，Keap1是聯系兩條信號通路的直接信號分子，NF-κB通路中的p65可以增強Keap1的穩定性從而增強對Keap1-Nrf2-ARE通路的抑制作用[11]，而Keap1也能抑制NF-κB信號通路[7]。可見，Keap1的表達水平對機體抗氧化應激通路和NF-κB通路的活性均有重要意義。

圖4 熔解曲線分析

圖5 Keap1 mRNA在新西蘭兔不同組織中的表達情況

本試驗建立了Keap1基因的熒光定量PCR方法，并通過構建的標準質粒建立了標準曲線，擴增得到了良好的S型曲線。熔解曲線分析顯示擴增產物熔解溫度均一，平均為90 ℃左右。所建立的方法具有良好的敏感性和重復性，可檢測到濃度為52.8拷貝/μL的樣品，組內、組間變異系數均小于5%。對新西蘭兔不同組織mRNA的檢測發現，Keap1基因在肝臟中表達最高，在脾臟中表達最低，這可能與各組織不同的生理功能有密切關系。本試驗建立了新西蘭兔Keap1基因熒光定量PCR檢測方法，并檢測了其在新西蘭兔各組織中的表達差異，為以新西蘭兔作為研究對象或模型動物的抗氧化應激相關研究奠定了基礎。