河南某斗雞原種場禽白血病病毒感染狀況監測

姬向波 ， 李新鋒 ， 謝娜娜 ， 高小韓 ， 李婉濤 ， 向瑞平

(1.河南牧業經濟學院實驗研究中心 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南省畜禽遺傳資源保護工程技術研究中心 ， 河南 鄭州 450046)

禽白血病病毒(Avian leukosis virus, ALV)屬于α反轉錄病毒群病毒屬成員，通常根據血清中和試驗、病毒宿主范圍、囊膜糖蛋白的抗原結構等將其劃分為A～J等10個亞群[1]。其中A亞群病毒是我國20世紀70年代雞場常見的外源性病毒，J亞型致瘤性較強，90年代曾在我國白羽肉雞和蛋用型雞中感染蔓延，造成巨大經濟損失[2-4]。經過連續多年的檢疫和凈化，我國白羽肉雞和蛋用型雞的ALV感染得到有效控制，但地方品種雞群中ALV感染還很普遍，且呈一定的上升趨勢，嚴重影響了地方雞種種質資源的保護和利用[5-7]。

河南某斗雞原種場擁有2 400多羽原種公雞和12 000多羽原種母雞，受該場委托調查其核心種雞群的ALV感染狀況，于2017年1月-2018年7月期間，分別采集該場核心種雞群的雛雞胎糞、泄殖腔棉拭子、血清、精液等樣品進行檢測，并對該場ALV分離株進行基因序列分析，明確了該場核心種群ALV的感染狀況，為該場建立禽白血病凈化措施提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 ALV-p27 ELISA檢測試劑盒為荷蘭Biochek公司產品，ALV-A/B、ALV-J亞型抗體ELISA檢測試劑盒為美國IDEXX公司生產。DF-1細胞系由洛陽普萊柯生物有限公司惠贈。DMEM、胰酶和FBS為美國Gibco公司產品。PCR引物由生工Sangon Biotech(武漢)公司合成。Ezup柱式病毒DNA抽提試劑盒和DNA Marker為生工生物工程(上海)股份有限公司產品。

1.2 樣品采集 按照參考文獻[8-9]，分別6次采集某河南斗雞原種場核心雞群的雛雞胎糞、泄殖腔棉拭子、公雞精液等樣品。樣品基本信息見表1。每只雞都戴有腳號，對號采集樣品并進行編號，低溫運輸，及時檢測。

表1 采集樣品基本信息

1.3 ALV-A/B、J亞型抗體、p27抗原檢測 采用ELISA方法對采集的樣品進行檢測。泄殖腔棉拭子和精液樣品進行ALV-p27抗原檢測，檢測前反復凍融3次，離心取上清作為待檢樣品；血清樣品進行ALV-A/B亞型、J亞型抗體檢測。

1.4 病毒分離鑒定 按照參考文獻[8]，將33份ALV-p27抗原陽性的雞血漿0.5 mL分別接種于DF-1細胞，同時設正常DF-1細胞作為陰性對照。37 ℃孵育2h，吸棄血漿，加入含1% FBS的DMEM培養9 d。培養結束后經凍融處理，離心，取100 μL細胞上清液進行ALV-p27抗原ELISA檢測，剩余細胞液用于提取ALV前病毒基因組。

1.5env基因的擴增、測序和同源性分析

1.5.1 引物設計與合成 參照A亞型RSA株、J亞型HPRS103株、E亞型JS14Z01株的env序列，設計可擴增3個ALV亞型env基因的通用引物，上游：5′-AGACCTACCGTTCTTACAG-3′； 下游：5′-CCCTCCC-TATGCAAAAGC-3′。預期擴增片段約2 000 bp。

1.5.2env基因的擴增和測序 取1.4制備的DF-1細胞，按照病毒DNA抽提試劑盒說明書，制備ALV前病毒DNA，以其為模板，PCR擴增env基因。擴增后采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，將與目的片段大小一致的PCR產物送至生工Sangon Biotech(武漢)有限公司，進行序列測定。

1.5.3 分離株env基因同源性分析 應用Lasergene 7.0軟件，將該場分離的2株env基因核苷酸序列與參考毒株進行同源性比對，分析env基因的變異情況，采用MEGA 6.0構建ALV分離株env基因的遺傳進化樹。

2 結果

2.1 ALV-p27抗原、ALV- A/B、J亞型抗體檢測結果 各樣品檢測結果見表2，由表可知，首次檢測時，該場核心雞群雛雞胎糞ALV-p27抗原檢出率為0，第二次檢測對象為核心群開產母雞，其ALV-p27抗原陽性率高達84.48%，ALV-A/B亞型抗體陽性率為17.14%，未檢測到ALV- J亞型抗體。5個月后，該核心雞群的ALV p27抗原陽性率升高至88.00%，且ALV-A/B亞型、J亞型抗體分別增至79.31%和24.14%。至2017年12月，核心群整體的ALV-p27抗原陽性率為78.10%，7個月后，陰性留種公雞ALV-p27抗原陽性率又升至9.52%。由此可知，該場核心雞群泄殖腔ALV-p27抗原陽性率在檢測期內持續在較高范圍內，但抗體陽性率在不同檢測時間的差別較大。該結果說明該場核心群ALV-p27抗原陽性率很高，血清抗體以ALV-A/B亞型為主。

2.2 病毒分離鑒定 33份泄殖腔棉拭子ALV-p27陽性雞血漿，接種DF-1細胞，培養9 d后，細胞培養液上清p27抗原ELISA檢測陽性6份，占泄殖腔棉拭子ALV-p27陽性群的18.00%。分離到的6株ALV分別命名為HNDJ1701-HNDJ1706。

表2 ALV- p27抗原、ALV- A/B、J亞型抗體檢測結果

2.3env基因的擴增和測序 以ALVenv基因通用引物對6份ALV前病毒env基因進行擴增，獲得約2 000 bp的基因片段，與預期大小一致，結果見圖1。

圖1 env基因的PCR擴增結果

2.4env基因同源性分析 對分離自該場的2株分離株HNDJ1701和HNDJ1702的env基因進行了基因序列比對，該場2株分離株的同源性為90.8%， HNDJ1701與國內分離株ALV-A亞型SDAU09E2株、ALV-J亞型HPRS株的同源性分別為89.2%、56.4%，HNDJ1702與SDAU09E2株和HPRS株的同源性分別為89.2%和56.0%；HNDJ1701和HNDJ1702與國內近年來報道的ALV-K亞型JS11C1株同源性均在88.00%以上，與國內分離的ALV-E亞型JS14CZ01株和SD0501株的同源性分別為88.3%、88.3%和89.4%、90.5%(見圖2)。

運用MEGA軟件繪制的ALV遺傳進化樹結果見圖3，可知該場HNDJ1701和HNDJ1702兩個分離株在同一分支，且與2009年國內A亞型SDAU09E2H和K亞型JS11C1的所屬分支較近，但與J亞型早期分離株HPRS103及國內近年來的J亞型分離株所屬分支親緣距離較遠。

3 討論

與發達國家相比，我國地方品種雞的抗病育種工作起步較晚，缺乏規模化養殖和規范的疫病監控措施[10]。近年來，按照《我國中長期動物疫病防治規劃(2010-2020年)》要求，許多地方品種雞規模化養殖場開始著手進行相關疫病的檢疫和凈化工作。目前，禽白血病凈化過程中常用的ALV病毒ELISA檢測方法，可檢測泄殖腔棉拭子、胎糞、血清和蛋清等樣品中的ALV p27抗原含量，操作簡單、快速，其中以泄殖腔樣品的采集最為簡便、且檢出率較高[11]。監測結果顯示，該核心雞群生產的第1批雛雞胎糞ALV-p27抗原陽性率為0，但成年雞的ALV-p27抗原陽性率高達80%以上。導致該結果的原因有：(1)雛雞胎糞樣品本身ALV-p27抗原的檢出率低，且抽檢樣品數量太少，不能反映核心群ALV感染狀況；(2)雖然2次隨機抽檢的陽性雞已及時淘汰，但由于陽性率高，而抽檢數量少，未淘汰所有陽性雞；(3)種公雞血漿分離到外源ALV病毒，可能通過人工授精水平傳播導致ALV感染率高。

考慮到該場品種選育對核心種群數量的要求，不能簡單采取淘汰泄殖腔棉拭子ALV-p27陽性雞的凈化方法。從核心群ALV-p27抗原陽性雞群隨機采集33份血漿，進行病毒分離培養和鑒定。結果表明，外源性ALV分離率在泄殖腔棉拭子ALV-p27陽性群體中占比為18%。該結果與前人的研究較為一致，即雞場在實施ALV凈化的初期不應采用以泄殖腔ALV-p27抗原陽性作為淘汰雞只的標準，因為在實際生產中發現，臨床健康雞群的泄殖腔ALV-p27抗原陽性最高可達30%，說明存在較高的假陽性[12]。因此，該場在ALV凈化初期，應采血鑒定雞只是否感染外源性ALV作為淘汰雞只的標準，待擴群數量可滿足育種需求時，再采集雛雞胎糞、血清等樣品進行檢測，并提高凈化標準。

研究顯示，env基因是ALV致腫瘤的關鍵性基因，隨病毒適應宿主而發生進化時最易發生變異，近年來在凈化選擇壓力下，新分離ALV毒株env基因與早期分離株的同源性差異逐漸變大[13]。本研究中，隨機選取的2株分離株env基因同源性為90.5%，通過與國內近年來各亞型分離株的序列比對表明，其在分支上基本歸屬于ALV-A亞型，與J亞型親緣關系較遠，說明該場核心雞群存在一定的外源性ALV感染，且以A亞型為主。目前，未觀察到該核心雞群有明顯的腫瘤性疾病，這基本符合ALV-A亞型感染的臨床表現，如生長緩慢、死亡率較高、產蛋量、孵化率和出雛率等生產性能低下[14]。該結果與目前我國地方品種雞群中的ALV流行趨勢較為一致[15-16]，也與該場目前未引進外源品種進行雜交的實際情況相符。隨著地方品種雞養殖規模的擴大和雞群流動性的增加，ALV-A在我國地方品種雞群中的流行傳播日趨嚴重，對地方品種資源保護造成較大威脅，應盡快采取措施進行ALV的檢測和凈化。

圖2 分離株與不同亞型ALV env基因核苷酸同源性比對

圖3 基于env基因的ALV核苷酸序列進化樹