多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計數參考品的研究

王秀麗 ， 劉 博 ， 辛凌翔 ， 杜 微 ， 鄧智昕 ， 巫月生 ，袁 沐 ， 李 建 ， 張一幟 ， 彭國瑞 ， 蔣玉文 ， 張 媛

(1.中國獸醫藥品監察所 ， 北京 海淀 100081 ； 2.肇慶大華農生物藥品有限公司 ， 廣東 肇慶 526238 ；3.廣東永順生物制藥股份有限公司 ， 廣東 廣州 511356)

巴氏桿菌病是由巴氏桿菌屬細菌所致動物的傳染病，可引起多種畜禽出血性敗血癥，故稱為多殺性巴氏桿菌病[1]，《中國獸藥典》二一五年版[2]收錄的活疫苗有禽多殺性巴氏桿菌病活疫苗(B26-1200株)、禽多殺性巴氏桿菌病活疫苗(G190E40株)、豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(679-230株)、豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(C20株)、豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)、豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯活疫苗，活菌計數是以上多殺性巴氏桿菌類活疫苗的重要參數，計數結果準確對于控制疫苗的安全性和免疫效力也有重要意義。在生物制品檢驗中增加參考品以更客觀、科學的評價檢驗結果是未來的一種趨勢，國外以及國內人用生物制品參考品的研究及應用越來越廣泛[2-3]。

活菌計數受到多種因素影響，如培養基質量、培養條件、平板表面濕度、檢驗員的主觀差異等，導致按標準操作規程計數結果不一致。在近幾年檢驗中，多次出現初次檢驗不符合規定，更換培養基或檢驗員重檢符合規定的情況。目前我國尚無活菌計數的參考品，也無控制培養基促生長能力的參考品，對影響活菌計數結果的關鍵因素無法科學評價，更無法評價活菌計數結果的有效性。活菌計數的參照物在美國細菌類疫苗如多殺性巴氏桿菌和豬丹毒桿菌活疫苗的檢驗中已應用多年[4-5]。我國沙門菌類活菌計數參考品的研究已經完成[6]，并已初步應用于沙門菌類活疫苗活菌計數的檢驗中，也在檢驗用普通瓊脂培養基的質量控制中應用。本研究試圖研制多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計數參考品，以期更加科學評價多殺性巴氏桿菌類疫苗活菌計數的結果。

1 材料與方法

1.1 參考品候選物的制備及分發 按照《中華人民共和國獸用生物制品規程》[7]的方法，制備一批(500瓶)豬多殺性巴氏桿菌病活疫苗(EO630株)，作為參考品候選物。按照現行《中國獸藥典》三部對參考品候選物的性狀、純粹、活菌計數、真空度測定、剩余水分等參數進行檢驗。從500 瓶參考品候選物中隨機抽取100 瓶，置于隔熱泡沫塑料盒內，并放入生物冰袋，最外層包裝紙箱，快遞至A單位、B單位和C單位，收到樣品后立即置于-70 ℃以下冰箱中保存[8]。

1.2 培養基、試劑及耗材 用6批原材料按《中華人民共和國獸用生物制品規程》二年版附錄配制6批馬丁瓊脂，用上述培養基分別加入同一批健康牛血清和裂解血細胞全血，傾注平板，由2名檢驗員分別對隨機抽取的3瓶參考品候選物進行活菌計數，篩選出適宜的培養基原材料。用篩選出的原材料制備馬丁肉湯和馬丁瓊脂培養基，密封后于2～8 ℃保存。健康牛血清,購自Gibco公司，裂解血細胞全血由本實驗室制備。1 mL、10 mL一次性吸管購自Costar公司，一次性平皿(直徑90 mm),購自青島金典生化器材公司。A、B、C三家單位所用的試驗耗材完全一致。

1.3 均一性試驗 參考文獻[6]和文獻[9]的方法。

1.4 協作標定 分別隨機抽取100 瓶參考品候選物、100瓶馬丁瓊脂(100 mL/瓶)、100瓶馬丁肉湯(240 mL/瓶)及相關耗材寄給B單位和C單位，A、B、C 3 家單位分別隨機抽取2 名檢驗員，每位檢驗員對3 瓶參考品候選物進行活菌計數，每瓶疫苗進行2 次重復試驗，統計不同檢驗員在不同時間、不同實驗室活菌計數的結果[10]。根據CNAS-GL02:2006 《能力驗證結果的統計處理和能力評價指南》[9]中穩健統計方法，計算Z比分值，剔除結果不滿意的數據，計算活菌計數的幾何平均數±2SD作為參考品候選物的菌數范圍。

1.5 運輸穩定性試驗 B單位和C單位分別從100瓶參考品候選物中隨機抽取5 瓶用1.1的方式寄到A單位，A單位收到樣品后馬上進行活菌計數，運輸過程均需2 d，分析運輸過程對樣品穩定性的影響。夏季(7月份)和冬季(12月份)分別試驗1次。

1.6 加速破壞試驗 隨機抽取參考品候選物，分別置于2～8 ℃、25 ℃、37 ℃、-20 ℃條件下，2～8 ℃、25 ℃、37 ℃條件下保存的樣品每隔若干天隨機抽取3瓶進行活菌計數、-20 ℃保存的樣品每隔6個月隨機抽取3瓶進行活菌計數，分析樣品在不同儲存條件下的穩定性[11]。

1.7 保存期試驗 將置于-70 ℃以下保存的參考品候選物按1.4的方法每1～2個月取樣并計數，至保存期24個月，對計數結果進行統計分析，每隔6個月對其性狀、真空度、剩余水分測定1次。

1.8 參考品的應用 2017-2019年多殺性巴氏桿菌類疫苗活菌計數的檢驗中，加入參考品作為對照，每次檢驗隨機抽取3瓶參考品，其中至少2瓶參考品計數結果在標定范圍內時對照成立，對待檢疫苗進行結果判定。

2 結果

2.1 參考品候選物的檢驗 參考品候選物性狀為海綿狀疏松團塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，隨機抽取5瓶疫苗進行純粹檢驗，結果5/5純粹，真空度測定結果顯示，參考品呈白色或粉色或紫色輝光，隨機抽取4瓶參考品測定剩余水分，結果為1.4%、1.5%、1.4%、2.2%，均小于3.0%，活菌計數結果為4.5×108CFU/頭份。

2.2 培養基的篩選 由2名檢驗員用6批馬丁瓊脂培養基(含4%健康牛血清和0.1%裂解血細胞全血)對相同的3瓶樣品進行活菌計數。2名檢驗員對6瓶樣品計數結果的中位數均為2號培養基(表1)，故選2號培養基的原材料配制馬丁瓊脂300瓶，100 mL/瓶，配制馬丁肉湯400瓶，240 mL/瓶，均密封后置于2～8 ℃保存備用。

表1 參考品用6批馬丁瓊脂培養基計數結果

2.3 均一性試驗 結果顯示，對隨機抽取的10瓶參考品候選物計數結果的變異系數為5.4%，小于10%，說明均一性良好(表2)[12]。

表2 均一性試驗結果

2.4 協作標定 A、B、C 3 家單位6名檢驗員對18 瓶參考品候選物計數結果為(×108CFU/頭份)：5.0，4.9，5.3，5.9，4.9，4.6，4.9，5.4，4.2，4.4，5.3，4.9，5.0，4.6，4.5，5.0，4.8，4.6，5.4，5.3，5.2，5.3，5.2，5.3，4.9，4.9，4.6，4.9，4.9，4.5，4.7，4.5，4.3，4.8，4.4，4.6。用穩健統計法分析， 36/36結果滿意，對36個結果進行統計，XM±2SD為(4.2，5.6)×108CFU，定為該批次參考品候選物活菌數的標定范圍。

2.5 運輸穩定性試驗 第1次運輸穩定性試驗(冬季，12月份)：B單位和C單位寄回的5瓶參考品候選物計數結果的最小值分別為4.3×108CFU/頭份和4.2×108CFU/頭份；第2次運輸穩定性試驗(夏季，7月份)：B單位和C單位寄回的5瓶參考品候選物計數結果的最小值分別為4.3×108CFU/頭份，4.5×108CFU/頭份。本參考品候選物保存期0個月時計數結果為4.5×108CFU/頭份，運輸后計數結果與之前無明顯差異，說明該參考品候選物在48 h內的運輸穩定性良好(表3)。

表3 運輸穩定性試驗結果

2.6 加速破壞試驗 加速破壞試驗結果顯示，25 ℃保存4 d，結果穩定，保存10 d，菌數下降15%；37 ℃保存2 d，結果穩定，保存10 d，菌數下降31%(表4)；真空度良好的條件下，4 ℃保存30 d菌數穩定；失真空后菌數在2～8 ℃保存菌數也會很快下降(表5)；-20 ℃保存的疫苗24個月內菌數無下降，結果穩定。

表4 參考品候選物加速破壞試驗 (37 ℃、25 ℃)

2.7 保存期試驗 按協作標定的方法對-70 ℃以下保存24個月以內的參考品候選物進行活菌計數，剔除結果不滿意的偏離數據，變異系數為7.2%～8.6%，均小于10%，平均數為4.7×108～4.8×108CFU/頭份，中位數為4.6×108～4.7×108CFU/頭份，均在活菌計數可接受的誤差范圍內，且計數結果在24個月內未隨保存時間的延長而降低，保存期為6個月、12個月、18個月、24個月時分別隨機抽取參考品候選物檢查性狀、真空度，結果均符合《中國獸藥典》的規定，剩余水分均小于3%[13]。

表5 參考品候選物加速破壞試驗(2～8 ℃)

2.8 參考品的應用 本參考品在應用過程中主要存在5種情況：(1)參考品對照成立，待檢疫苗不符合規定，這種情況下更換培養基重檢，檢測結果均與初次檢驗結果一致；(2)參考品符合規定，待檢疫苗不符合規定，但二者在37 ℃培養24 h菌落大小不一； (3)待檢疫苗和參考品結果均不符合規定，更換培養基對待檢疫苗和參考品重檢測，參考品結果符合規定，對待檢疫苗進行判定；(4)待檢疫苗和參考品均符合各自質量標準；(5)參考品不符合規定，待檢樣品符合規定，重檢后均符合規定(表6)。

表6 參考品的應用情況

3 討論

通過對多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計數參考品的系統研究，制定出參考品的質量標準：性狀、純粹檢驗、真空度測定、剩余水分測定的標準參照《中國獸藥典》；活菌計數標準為隨機抽取3瓶樣品，按現行《中國獸藥典》附錄用馬丁瓊脂和馬丁肉湯培養基進行檢驗，應有不少于2瓶參考品的計數結果在標定范圍內。當有大于1瓶計數結果不在標定范圍內或(37±0.5)℃培養18-24 h菌落大小不一時，應更換培養基重檢1次。均一性檢驗標準為隨機抽取10瓶參考品進行活菌計數，結果的變異系數應小于10.0%；運輸穩定性標準為將參考品置于2～8 ℃運輸不超過48 h，活菌數下降應小于10.0%。

多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計數參考已監測的保存期為2年，如臨期需換批時，對在保存期內的參考品用馬丁瓊脂進行計數，如果計數結果在標定范圍內，說明馬丁瓊脂的促生長能力適宜，用該馬丁瓊脂對新制備的參考品進行檢驗和協作標定，以確保參考品在換批時標準一致[14]。

參考品的應用結果顯示，本品可以應用于控制多殺性巴氏桿菌類活疫苗活菌計數的過程。每次檢驗均需用參考品對試驗結果的有效性進行判定。若一次檢驗中使用同一批培養基對多批檢品進行檢驗，則僅需用3瓶參考品對試驗結果的有效性進行判定。若一次檢驗使用不同批次的培養基，則每批培養基均需用3瓶參考品對試驗結果進行有效性判定。當3瓶參考品中至少2瓶計數結果在參考品標定范圍內，且(37±0.5)℃培養24 h菌落大小均勻一致時，判定試驗結果有效。

因豬丹毒活疫苗和巴氏桿菌類活疫苗檢驗均需用馬丁瓊脂，但對馬丁瓊脂的適應性不一致。豬瘟、豬丹毒、豬多殺性巴氏桿菌病三聯活疫苗活菌計數檢驗中，豬丹毒生長狀態良好，活菌計數結果符合規定。而多殺性巴氏桿菌未生長，更換培養基后二者均生長良好且計數結果符合規定，其原因待進一步探索。因此，本參考品應用于控制多殺性巴氏桿菌類疫苗檢驗用培養基的質量有重要意義。

本品應用于控制多殺性巴氏桿菌類疫苗檢驗用馬丁瓊脂培養基質量時，每批培養基用3瓶參考品進行檢驗，當不少于2瓶參考品計數結果在參考標定范圍內，且在(37±0.5)℃培養24 h，菌落大小均勻一致時，判定培養基促生長能力符合規定。若參考品計數結果高于參考品標定范圍，提示培養基的促生長能力偏高，反之則偏低。因此應在多殺性巴氏桿菌類活疫苗檢驗用培養基質量標準中添加促生長能力檢驗參數，符合規定的培養基用于檢驗，可以避免不必要的重復工作。多殺性巴氏桿菌類疫苗(包括滅活疫苗)的配苗及效力檢驗(免疫攻毒法)也需計數。參考品的應用對多殺性巴氏桿菌類疫苗的生產及檢驗均具有重要的意義。

加速破壞試驗結果顯示：用卡鉑瓶凍干的參考品置于-70 ℃以下保存時易失真空，失真空后菌數明顯下降，不能滿足應用的要求。本實驗室已用安瓿凍干本品，以保證參考品的真空度符合規定，其保存期可進一步監測。