鹿茸多肽對不同誘導劑致人肝細胞系L-02氧化損傷的保護作用

張宸豪 ， 駱曉峰 ， 李明光 ， 李 瑤 ， 李正祎

(吉林醫藥學院檢驗學院 , 吉林 吉林 132013 )

肝損傷是肝臟常見的病理損害,同時也是導致肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要原因之一。肝損傷過程與氧化應激密切相關。氧化應激導致肝細胞膜脂質過度氧化，干擾細胞能量代謝,并最終導致細胞死亡[1-2]。乙醇、四氯化碳和過氧化氫在肝細胞內的代謝可以增加細胞內活性氧(ROS)水平，導致細胞內大分子損傷和細胞死亡[3]，因此它們是體外建立肝損傷模型的常用誘導劑。鹿茸多肽(Velvet Antler Polypeptide，VAP)是雄性梅花鹿茸中提取的最具活性的小分子蛋白,我們以前的研究證明鹿茸多肽具有促進肝細胞再生、抑制四氯化碳誘導的大鼠肝纖維化的藥理作用[4-6]。本試驗以乙醇、四氯化碳和過氧化氫為誘導劑，建立體外肝損傷模型，觀察VAP對L-02細胞損傷后的保護作用并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 L-02細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫；鹿茸多肽，吉林大學藥學院惠贈；DMEM高糖培養液，購自Gibco 公司；胎牛血清，購自Hyclone公司；MTT，購自Sigma公司；DMSO，購自天津科邁歐化學試劑有限公司；Hoechst 33342，購自Sigma公司；羅丹明123，購自Amresco公司；四氯化碳，購自天健凱通化學試劑有限公司；30%H2O2，購自天健達茂化學試劑公司 。

1.2 細胞培養與處理 L-02細胞復蘇后在含10%胎牛血清DMEM高糖培養液、5%CO2、飽和濕度、37 ℃ 條件下培養。取對數生長期細胞用于試驗。試驗分為模型組(Model)、VAP治療組(VAP)和空白對照組(Control)。模型組分別用不同濃度(0、0.5%、1%、3%、6%、12%)乙醇，不同濃度(0、2.5 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM)的四氯化碳和不同濃度(0、0.25 mM、0.50 mM、1 mM、2 mM、4 mM)的過氧化氫作用在L-02細胞上。根據IC50數值選取6%乙醇、20 mM四氯化碳和1mM過氧化氫作用于L-02細胞[7-8]。VAP治療組分為低VAPL，中VAPM和高VAPH三組，濃度分別為0.4 mg/mL、0.8 mg/mL和1.6 mg/mL。對照組僅給予DMEM高糖培養液，無藥物作用。

1.3 MTT法檢測細胞增殖 取對數生長期的L-02細胞，以1×104個細胞/孔接種于96孔培養板中，培養24 h細胞貼壁后按上述組別給予藥物處理細胞，每個處理因素設3個復孔。 培養24 h后，向細胞中加入20 μL MTT(5mg / mL)。繼續孵育4 h，棄去培養基，并向每個孔中加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)。震蕩5 min后，在570 nm處測量吸光度(A)值。試驗重復3次，計算細胞存活率。細胞存活率=處理組平均A值/ 對照組平均A值×100%。

1.4 Hoechst 33342染色檢測細胞凋亡 Hoechst 33342與凋亡細胞染色質結合后發出強烈的藍色熒光，與正常細胞區別。取5×105個細胞/孔的L-02細胞接種于24孔板中，按上述組別處理細胞12 h后更換含有不同濃度的VAP，作用24 h后PBS洗3次。 加入新鮮制備的4%多聚甲醛固定細胞10 min。用PBS洗滌后，加入Hoechst33342(10 μg/mL)避光孵育15 min。PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡。每組隨機選取5個不同視野，用Image J軟件計算每張圖片(相同放大倍數下)總細胞數和Hoechst 陽性細胞數。試驗重復3次，取細胞凋亡百分率均數值。

1.5 線粒體膜電位測定 羅丹明123(Rhodamine 123，Rh123)是一種可被線粒體吸收的熒光染料，其吸收值隨細胞線粒體膜電位(Mitochondria membrane potential，MMP)的改變而呈相應的變化，從而改變細胞的熒光強度。因此，可通過檢測細胞內Rh123 熒光強度反映細胞MMP的變化。取5×105個細胞/孔的L-02細胞接種于24孔板中，按上述組別處理細胞12 h后更換含有不同濃度的VAP，作用24 h后PBS洗3次。取羅丹明123 染液(0.1 μg/mL)作用細胞避光孵育30 min，PBS沖洗后熒光顯微鏡下觀察攝片。隨機選取5個不同視野，用Image J軟件分析圖片的熒光強度進行統計分析。試驗重復3次，取累計光密度均數值。

1.6 細胞內ROS水平的檢測 將5×105個細胞/孔L-02細胞接種到24孔板中，處理12 h后更換含有不同濃度的VAP，作用24 h后用PBS洗滌3次。H2DCFDA(10μM)加入到細胞中繼續避光孵育30 min。用PBS洗滌后在熒光顯微鏡下觀察細胞。隨機選取5個不同視野，用Image J軟件對圖像進行熒光強度分析。試驗重復3次，取累計光密度均數值。

1.7 統計學分析 采用SPSS19.0統計軟件進行處理,試驗數據以“平均值 ± 標準差”表示,采用t檢驗對試驗數據進行差異顯著性分析，P<0.05表示差異有統計學意義，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 VAP可以抑制L-02細胞的損傷 不同濃度乙醇、四氯化碳和過氧化氫能顯著抑制L-02細胞生長(圖1)。與空白對照組相比，模型組細胞存活率下降明顯；而治療組與模型組相比能顯著提高乙醇、四氯化碳和過氧化氫引起的細胞存活率下降，并且呈劑量依賴性方式增加(圖2)。

2.2 VAP對不同誘導劑作用L-02細胞凋亡的影響 6%乙醇、20 mM四氯化碳和1 mM過氧化氫能顯著改變L-02細胞的核形態，核凝集，增加細胞凋亡百分率，與空白對照組相比差異顯著。治療組與模型組相比能顯著抑制L-02細胞核的凝集，減少細胞核形態變化，降低了凋亡百分率。

圖3 VAP對受損L-02細胞凋亡的影響

2.3 VAP對不同誘導劑作用L-02細胞MMP的影響 6% 乙醇、20 mM四氯化碳和1 mM過氧化氫可引起的L-02細胞MMP顯著下降，細胞內Rh123熒光強度與空白對照組相比明顯降低。而治療組與模型組相比則能顯著地抑制6%乙醇、20 mM四氯化碳1 mM過氧化氫引起的MMP下降，增加了Rh 123的熒光強度(封二彩版圖4)。

圖4 VAP對受損L-02細胞線粒體膜電位變化的影響

圖1 乙醇、四氯化碳和過氧化氫對L-02細胞生長的影響

圖2 VAP對L-02細胞損傷的保護作用

2.4 VAP對不同誘導劑作用L-02細胞ROS的影響 用6% 乙醇，20 mM四氯化碳和1 mM過氧化氫處理L-02細胞后導致細胞內ROS顯著增加，細胞內熒光強度與空白對照組相比顯著增加。而治療組可降低細胞內熒光強度，減少細胞內ROS的產生(封二彩版圖5)。

圖5 VAP對受損L-02細胞ROS產生的影響

3 討論

氧化應激是肝損傷的關鍵因素，而ROS在肝損傷的氧化應激中發揮重要作用。乙醇在肝細胞中乙醇脫氫酶作用下轉化為乙醛，使NAD+轉變為還原型NADH，NADH / NAD+的比例增加，從而抑制了脂肪酸β的氧化，最終導致細胞內脂肪的積累。在乙醇代謝過程中，超氧陰離子自由基、過氧化氫、羥基自由基等ROS水平升高，對蛋白質、核酸等大分子造成破壞[9-10]；四氯化碳通過傷害肝細胞膜脂質代謝細胞色素P450·CCl3等自由基，引起肝細胞凋亡[11-12]；H2O2是一種常見的氧自由基，通過脂質過氧化作用誘導細胞膜損傷[13],低濃度下即可對L-02細胞造成較強損傷。因此，乙醇，四氯化碳是體內和體外建立酒精性肝病，化學性肝損傷模型的理想誘導劑。至于過氧化氫，它可以模擬各種肝臟損傷的氧化應激。研究表明，VAP不僅可以抑制四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化，還可以抑制四氯化碳誘導的氧化作用。此外，VAP可以降低肝細胞的超微結構變化[14]。另外，鹿茸中含有多種生長因子以及近年來發現的活性多肽單體[15]，它們具有促進傷口愈合和促進細胞增殖的作用。因此，VAP對L-02細胞的保護作用可能與其促進細胞生長，抑制乙醇，四氯化碳，過氧化氫對L-02細胞的氧化損傷有關。

本試驗證實,VAP能顯著抑制乙醇，四氯化碳，過氧化氫對L-02細胞的損傷，提高L-02細胞的體外存活率。Hoechst 33342染色證實,VAP可抑制L-02 細胞核的凝集和減少細胞核形態改變。 Rh123染色證實VAP可抑制L-02細胞損傷引起的膜電位變化。VAP降低了L-02細胞中ROS的產生，提高了SOD和GSH的水平。VAP對L-02細胞的保護作用與VAP的抗氧化能力有關。但是，VAP對L-02細胞保護作用的分子機制還有待進一步研究。