奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌luxS及pfs基因表達及AI-2體外合成

曹素芳 ， 王金合 ， 皇甫和平 ， 康 宇 ， 陳奎榮 ， 陳淑慧 ， 張 凡 ， 趙雯娟 ， 楊永磊

(河南牧業經濟學院動物醫學院 ， 河南 鄭州 450046)

致病性大腸桿菌能夠引起奶牛乳房炎、犢牛腹瀉等疾病的病原。其中大腸桿菌是引起奶牛乳房炎主要病原菌之一，對奶牛業危害較大，每年造成的直接或間接經濟損失較大。目前，大腸桿菌引起奶牛乳房炎的致病機制仍未十分明確，與單個游離狀態的大腸桿菌不同，引起奶牛乳房炎的大腸桿菌來自于環境[1]，只有當環境中的存在大量致病性大腸桿菌時，才容易通過乳頭孔進入奶牛乳房中導致炎癥，但環境中的致病性大腸桿菌是通過什么機制進入奶牛乳房中引起乳房炎，目前還不十分清楚。有研究表明，細菌感染動物導致疾病與細菌的密度感應(Quorum sensing，QS)系統有關，QS又稱細菌的群體感應，是細菌間通過產生和交換可擴散信號分子進行信息交流，以協調群體行為的過程[2]。QS是保護細菌適應復雜外界環境的重要機制。在QS系統中，信號分子是細菌間傳遞信息的關鍵，它可通過QS在細菌之間進行信息傳遞，導致特定基因的表達[3]。研究顯示，大多數革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有QS系統，其中重要的QS為LxuS/AI-2密度感應系統，該系統最早發現于哈維弧菌。Mukesh K.Yadav等[4]研究表明，LxuS/AI-2系統決定豬鏈球菌對宿主的感染能力。Fang-Fang Jia等[5]研究發現，LxuS蛋白在乳桿菌的抗逆性和粘附性方面起著關鍵作用。Xiaoka Wu等[6]研究顯示，催化合成AI-2蛋白的pst基因在禽致病性大腸桿菌感染宿主中至關重要。盡管有許多證據表明，LxuS/AI-2密度感應系統在細菌的致病性具有重要作用，但該系統在致病性大腸桿菌引起奶牛隱性乳房炎過程中的調控機制還未見報道，為了探索奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌中的LxuS/AI-2的調控機制，本試驗通過對奶牛隱性乳房炎中的致病性大腸桿菌E285的luxS基因和pfs基因進行克隆、表達及純化，獲得E285的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白，將獲得的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白體外催化SAH(S-adenosyl homocysteine，SAH)合成AI-2信號分子，為進一步深入研究AI-2信號分子對奶牛致病性大腸桿菌的毒力基因表達、生物被膜形成、毒素合成等的調控奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌E285為本實驗室分離保存的；大腸桿菌DH5α為本實驗室保存；宿主菌BL21(DE3)購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.2 主要試劑 MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit、ExTaq酶、EcoRI、HindIII、DNase、蛋白Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司；羊抗兔IgG(IgG-HRP)，購自Abcam@公司產品；質粒pET-30a(+)為韓先干博士惠贈；質粒提取試劑盒、NC膜，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；IPTG，購自Sigma公司。His標簽蛋白純化試劑盒(可溶性蛋白)，購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據GenBank中發表的luxS(YP-001199965)和pfs(NC-009443)基因序列，分別設計并合成luxS和pfs基因的特異性引物，luxS基因引物：luxS-F: 5′-CCGGAATTCATG CCGTTGTTAGATA GCTT-3′,luxS-R:5′-CCCAAGCTTCTAGATGTGCAGTTCCTG-3′;pfs基因引物：pfs-F：5′-CCGGAATTCATGAAAATCGGCATCATTGGTG-3′,pfs-R：5′-CCCAAGCTTTTA GCCATGTGCAAGTTTCTG-3′。上游引物加有EcoRI酶切位點(下劃線)，下游引物加有HindIII酶切位點(下劃線)。

1.2.2 E285的luxS及pfs基因PCR擴增 取凍存的奶牛隱性乳房炎中致病性大腸桿菌E285培養過夜，提取細菌DNA，以細菌DNA為模板進行luxS基因及pfs基因擴增。

在25 μL體系中加入10×ExTaqBuffer 2.5 μL,4dNTP 1 μL,luxS基因或pfs基因上下游引物各0.5 μL，細菌DNA 1 μL，ddH2O 19 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，混勻進行PCR擴增，擴增條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，30個循環；72 ℃ 10 min，電泳檢測結果。

1.2.3 重組表達載體的構建 將獲得的PCR產物luxS片段、pfs片段及表達載體pET-30a(+)分別用EcoRI和HindIII進行雙酶切，回收后，分別插入pET-30a(+)相應的酶切位點中，連接產物轉化DH5α，挑取疑似菌落于含Kan+的LB液體中，培養過夜，提取質粒，進行PCR、酶切鑒定及序列測定。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 將鑒定正確的重組質粒pET-luxS和pET-pfs分別轉化BL21中，挑取單個菌落接種于含50 μg/mL Kan+的LB液體培養基中，37 ℃振蕩培養至OD600nm值為0.6～0.8時，加入終濃度為0.001 mol/L的IPTG，37 ℃誘導6 h，取誘導表達的菌液1.5 mL，12 000 r/min離心10 min，去上清，沉淀加入適量的ddH2O進行重懸，超聲破碎，離心收集上清進行SDS-PAGE。

1.2.5 重組蛋白純化 將重組pET-luxS表達菌及pET-pfs表達菌分別進行大量培養，按1.2.4進行誘導表達，離心收集菌體，加入60 mL超聲裂解緩沖液，混勻，再加入終濃度為50 μg/ mL的DNase，混勻，室溫作用30 min。進行超聲裂解，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，收集上清和沉淀，按His標簽蛋白純化試劑盒說明書純化，將收集的洗脫液進行SDS-PAGE。

1.2.6 多克隆抗體制備 取純化的重組LuxS蛋白和Pfs蛋白各1 mg，按1∶1與弗氏完全佐劑進行混合乳化。分別皮下免疫2只新西蘭大白兔，每只免疫1 mL。一免后再免疫2次，間隔均為2周，劑量相同。三免后2周心臟采血分離血清，56 ℃滅活，分裝，-20 ℃保存備用。

1.2.7 Western Blot 檢測 將收獲的表達上清進行SDS-PAGE電泳后轉移至NC膜上，NC膜用10%脫脂乳封閉過夜，加入多克隆抗體室溫作用2 h，PBST 洗滌3次，每次10 min,再加入HRP-羊抗兔IgG作用1 h,用PBST洗滌3次后進行顯色，觀察結果。

1.2.8 體外合成AI-2及活性檢測 分別取1 mg/mL純化的重組蛋白LuxS和Pfs，加入含SAH(1 mmol/L)的磷酸鈉緩沖液中，37 ℃反應1 h后用Millpore超濾膜過濾，測定濾液中AI-2蛋白的濃度，濾液于-80 ℃保存備用。

將哈維弧菌BB170接種于新鮮的AB培養基中，28 ℃培養過夜，菌液按1∶5 000稀釋后，分別體外合成的AI-2、陽性對照BB152培養上清和陰性對照DH5α培養上清，30 ℃培養5 h，用全自動多功能酶標儀檢測培養物的發光情況。每組重復4個孔。

2 結果

2.1luxS基因和pfs基因的PCR擴增 以特異性引物進行擴增luxS基因和pfs基因，結果顯示，擴增到的條帶分別約為516 bp和690 bp，與目的條帶大小一致(圖1)。表明PCR擴增到了目的片段。

圖1 luxS基因和pfs基因PCR擴增結果

2.2 重組質粒的鑒定

2.2.1 PCR及酶切鑒定 構建的重組質粒經PCR鑒定結果顯示，2個重組質粒均能擴增到和目的片段大小相同的片段(圖2A)。重組質粒pET-luxS分別用EcoRI、HindIII單酶切，均獲得了1條約5 938 bp條帶，與重組質粒大小一致；用EcoRI和HindIII雙酶切得到1條約5 422 bp和1條516 bp兩條帶，小帶與目的基因luxS基因大小相同；pET-pfs分別用EcoRI、HindIII單酶切，均獲得了一條約6 112 bp條帶，與重組質粒大小一致，用EcoRI和HindIII雙酶切得到1條約5 422 bp和1條690 bp兩條帶，小帶與目的基因pfs基因大小相同(圖2B、C)。PCR和酶切鑒定均證明重組質粒pET-luxS和pET-pfs構建成功。

圖2 重組質粒的PCR及酶切鑒定A：重組質粒pET-luxS 和pET-pfs PCR鑒定; B:重組質粒pET-pfs酶切鑒定； M：DL-2 000； 1：EcoR I+Hind III酶切； 2：EcoR I酶切； 3：Hind III酶切； M1：EcoT14; C:重組質粒 pET-luxS酶切鑒定; M1：EcoT14； 4: EcoR I酶切； 5:Hind III酶切； 6:EcoR I+Hind III酶切； M：DL-2 000

2.2.2luxS基因和pfs基因序列測定 將PCR鑒定和酶切鑒定正確的重組質粒送寶生物工程(大連)有限公司進行序列測定，結果表明,luxS基因和pfs基因均插入到載體pET-30a(+)中。本試驗獲得的luxS基因大小為516個核苷酸，pfs基因為690個核苷酸。將獲得的luxS基因核苷酸序列與IAI39 (NC_011750.1)、K-12 (NC_000913.3)、luxS(AJ786260.1)、UMN026(NC_ 011751.1)進行同源性比較，結果同源性均達到98.6%以上，其推導的氨基酸與它們的同源性達到99%以上。將pfs基因核苷酸序列與大腸桿菌EC590的pfs基因核苷酸序列(CP016182.21)比較結果顯示，它們間的同源性也達到99.9%，只有181位核苷酸不同(圖略)，其氨基酸序列同源性為100%。

2.3 重組質粒pET-luxS和pET-pfs表達純化 將含有重組質粒pET30a-luxS和pET30a-pfs的細菌進行培養，經IPTG誘導后進行SDS-PAGE，結果顯示，所構建的重組質粒pET-luxS和pET-pfs經誘導表達后，在24 kD和30 kD位置出現了較深的條帶，和目的蛋白LuxS和Pfs大小一致(圖3)，表明在luxS基因和Pfs基因在BL21中獲得了表達。重組質粒pET-luxS和pET-pfs表達的上清經過His標簽蛋白純化試劑盒純化(圖4)，經蛋白測定儀測定表達的目的蛋白濃度分別為4.6 mg/mL和5.3 mg/mL。

2.4 Western Blot鑒定重組LuxS和Pfs蛋白 將表達純化的LuxS和Pfs蛋白免疫新西蘭大白兔獲得的多抗，通過Western Blot鑒定后，在相應的位置出現了條帶(24 ku和30 ku)(圖4)，與預期結果相符。

圖3 重組蛋白LuxS和Pfs的 SDS-PAGE

圖4 重組蛋白LuxS和Pfs Western Blot檢測及其純化產物的SDS-PAGE

2.5 信號分子AI-2的體外合成及活性檢測 AI-2體外合成的結果表明 ，當純化的重組蛋白LuxS和Pfs與SAH同時作用后，其反應液經過濾后，測定濾液中的AI-2蛋白濃度為200 μmol/L，運用BB170可檢測其AI-2活性是陰性對照(DH5α) 的61倍(圖5) ，表明合成了具有生物學活性的AI-2。在AI-2的體外合成試驗中，僅Lux S或Pfs單獨作用于底物SAH時 ，其反應產物沒有檢測到明顯的AI-2活性(圖5) ，表明AI-2的體外合成需要LuxS和Pfs的同時參與。

3 討論

研究表明，革蘭陰性菌中存在LuxS/AI-2密度感應系統[7-8]，該系統中AI-2信號分子是同種細菌、異種細菌之間進行交流的“通用語言”，其合成需要兩種催化酶LuxS和Pfs的共同參與。目前，牛源大腸桿菌中AI-2信號分子研究不多，對其的調控機制也不十分清楚，本研究以AI-2的催化酶基因luxS、pfs為研究對象，成功構建了重組表達質粒，經PCR和酶切鑒定后進行序列測定及分析，結果表明，所獲得的luxS基因與GenBank中大腸桿菌中的已知序列高度同源，同源性達到99%以上，這與Surette等[9]的報道結果一致。說明luxS基因在細菌中高度保守。對獲得的pfs基因進行序列分析也表明，其序列也相對保守。

圖5 應用哈維弧菌BB170檢測體外合成的AI-2蛋白活性

本試驗將構建的重組質粒pet30a- luxS和pet30a-pfs轉化入BL21中，經IPTG誘導，結果表明,luxS基因和pfs基因均可在BL21中大量表達可溶性重組蛋白，與曹素芳等[10]研究結果一致。但與Chayen 等[11]研究結果不同。其原因可能是LuxS和Pfs與融合標簽6×His結合后提高了重組蛋白的可溶性。

許多研究發現，所有生物如真核生物、放線菌、藍細菌等均存在SAH轉變為AI-2分子循環途徑[8]，該循環過程需要LuxS和Pfs兩蛋白的催化作用。在本試驗中，將純化的重組蛋白LuxS和Pfs按不同量(1 mg/mL：0.5 mg/mL;1 mg/mL：1 mg/mL;1 mg/mL：1.5 mg/mL;1 mg/mL：2 mg/mL)混合于含SAH的磷酸鹽緩沖液中進行反應，反應液中合成的AI-2蛋白質含量測定及活性檢測結果顯示，重組蛋白LuxS和Pfs等量混合催化SAH獲得的AI-2蛋白含量最高(結果略)。本試驗還同時進行了重組蛋白LuxS或Pfs單獨催化底物SAH，檢測結果顯示，沒有獲得AI-2蛋白，所有試驗結果均證明AI-2蛋白合成必需LuxS與Pfs共同催化SAH才能完成，二者缺一不可，與韓先干等[12]研究結果相符。Hyunjoon Park等研究表明，大腸桿菌O157:H7缺乏LuxS蛋白就無法合成AI-2，本試驗的結果也與之一致。說明細菌中AI-2的合成是LuxS和Pfs蛋白催化SAH產生有活性作用的AI-2信號分子。本試驗體外合成的AI-2蛋白將為后續進一步研究該蛋白調控毒力基因的表達、生物被膜的形成及毒素的合成等提供物質支持。