HPLC-MS/MS法在白血病患者血漿維生素C水平測(cè)定中的臨床應(yīng)用*

孫文利，王欣俞，田文君，李明花，陳佳琦，王 磊，張建平，劉紅星△

(1.河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院，河北廊坊 065201；2.河北燕達(dá)醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北廊坊 065201；3.山東省立醫(yī)院臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)部，山東濟(jì)南 250021)

維生素C又稱(chēng)抗壞血酸，用于治療抗壞血病。人類(lèi)自身不能合成維生素C，只能通過(guò)食用新鮮的蔬菜、水果及藥物等途徑獲得。維生素C是一種高效的抗氧化劑，大量文獻(xiàn)研究報(bào)道維生素C在抵御癌癥上起著重要的作用，其作用機(jī)制是維生素C可以阻斷致癌物N-亞硝基化合物合成，預(yù)防癌癥[1-5]；還可以通過(guò)清除氧自由基保護(hù)細(xì)胞免受損傷及對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用[6]。維生素C能用來(lái)靶向并且殺滅癌癥干細(xì)胞[7]，增加人體食用維生素C可以降低人們肺癌風(fēng)險(xiǎn)[8]，高水平的維生素C可以有效抑制攜帶KRAS和BRAF突變基因的惡性結(jié)直腸癌[9]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明維生素C可以促進(jìn)造血干細(xì)胞死亡，用于治療白血病[10]。LIU等[11]研究發(fā)現(xiàn)，維生素C會(huì)增強(qiáng)地西他濱(5-aza-2′-deoxycytidine)的抗腫瘤作用，推測(cè)維生素C對(duì)某些惡性血液腫瘤治療有輔助效果；砷劑聯(lián)合維生素C治療急性早幼粒細(xì)胞白血病具有良好的臨床療效[12]；此外，在部分白血病患者中存在TET2基因突變，促進(jìn)白血病干細(xì)胞分化為成熟的最終會(huì)死亡的血細(xì)胞，CIMMINO等[13]研究證明維生素C具有激活TET2的功能從而用于白血病的治療。未服用維生素C制劑的白血病患者嚴(yán)重缺乏維生素C(血清維生素C<11.4 μmol/L)[11]，因此，對(duì)于血液病患者，適當(dāng)補(bǔ)充維生素C有一定治療意義。目前，測(cè)定血液病患者體內(nèi)維生素C水平的文獻(xiàn)較少，且國(guó)內(nèi)多采用高效液相色譜法測(cè)定維生素C水平[14-17]，本文建立了快速的、靈敏的、準(zhǔn)確的超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法，用于測(cè)定血液病患者血漿中維生素C的水平，為臨床上白血病患者營(yíng)養(yǎng)及治療上提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 主要儀器包括Qtrap 4000離子阱檢測(cè)器(美國(guó)AB公司)，島津HPLC 20A型高效液相色譜儀(日本島津公司)，色譜化學(xué)工作站(美國(guó)AB公司)，Vortex-Genie2 渦旋振蕩器(美國(guó)Scientific Industries公司)，全自動(dòng)高速冷凍離心機(jī)(Thermo Fisher)，電子天平(瑞士Sartorius公司)。試劑包括維生素C標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：6-EOD-174-1，規(guī)格：100 mg)，L-Ascorbic Acid-1-13C標(biāo)準(zhǔn)品(內(nèi)標(biāo)，批號(hào)：4-DXX-93-1，規(guī)格：5 mg)，均購(gòu)自Toronto Research Chemicals Canada；甲醇為色譜純(Thermo Fisher)，水為超純水(屈臣氏蒸餾水)，偏磷酸(批號(hào)：K11871，規(guī)格：500 mg，含量99%)為分析純，購(gòu)自山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司，甲酸為色譜純，乙酸銨為分析純。

1.2方法

1.2.1色譜與質(zhì)譜條件 (1)色譜條件。色譜柱XBridge?C18(4.6 mm×50.0 mm，5 μm)(Waters，Made in Ireland)，流動(dòng)相A：0.1%甲酸的甲醇溶液，流動(dòng)相B：2 mMol/L乙酸銨-0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脫(0.01～0.5 min，50%B→95%B；0.5～1 min，95%B保持0.5 min；1～1.5 min，95%B→50%B；1.5～2 min，50%B保持0.5 min)，流速為0.8 mL/min，柱溫60 ℃，進(jìn)樣量10 μL。(2)質(zhì)譜條件。采用電噴霧離子源(ESI)；以多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM)掃描，負(fù)離子方式檢測(cè)；離子噴射電壓(IS)：4 500 V；離子源溫度(TEM)：450 ℃；源內(nèi)氣體1(GS1，N2)壓力：55，氣體2(GS2，N2)壓力：55 V；Curtain gas：20；碰撞氣壓力：Medium；去簇電壓(DP)電壓：90V；碰撞能量(CE)20 V；入口電壓10 V；出口電壓15 V；用于定量分析離子對(duì)175.0→115.1(維生素C)，176.0→115.8(內(nèi)標(biāo)L-Ascorbic Acid-1-13C)。

1.2.2溶液制備 (1)精密稱(chēng)取維生素C標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用10%的偏磷酸溶液定容至10 mL，搖勻，得到濃度為1mg/mL的維生素C儲(chǔ)備液，再用偏磷酸將其稀釋?zhuān)渲瞥伤栀|(zhì)量濃度的維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，放置-20 ℃冰箱保存，備用。(2)精密稱(chēng)取內(nèi)標(biāo)L-Ascorbic Acid-1-13C標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，用10%的偏磷酸溶液定容至10 mL，搖勻，得到濃度為0.5 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，再用偏磷酸將其稀釋?zhuān)渲瞥少|(zhì)量濃度為10 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

1.2.3受試者選擇 隨機(jī)選取河北燕達(dá)陸道培醫(yī)院及山東省立醫(yī)院的白血病患者123例，男76例，女47例，年齡1～60歲。同時(shí)選取407名健康志愿者，男59例，女348例，年齡21～53歲。受試者均知情同意。

1.2.4血漿樣品處理

1.2.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品處理 取20 μL相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，加180 μL空白血漿，加入500 μL含有10 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液的10%偏磷酸溶液，渦旋混合1 min，13 000 r/min離心8 min，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

1.2.4.2待測(cè)血漿樣品處理 取200 μL待測(cè)血漿樣品，加入500 μL含有10 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液的10%偏磷酸溶液，渦旋混合1 min，13 000 r/min離心8 min，取上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾后進(jìn)樣分析。

1.2.5方法學(xué)考察

1.2.5.1專(zhuān)屬性 取空白血漿200 μL，按“1.2.4.2”項(xiàng)下處理(不含內(nèi)標(biāo))；在空白血漿中加入一定量的維生素C及內(nèi)標(biāo)L-Ascorbic Acid-1-13C的標(biāo)準(zhǔn)溶液，同樣按“1.2.4.2”項(xiàng)下處理；取患者血漿樣品，按同樣的方法處理，進(jìn)樣分析，考察方法的專(zhuān)屬性。

1.2.5.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下線 取空白血漿180 μL，分別加入20 μL相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成相當(dāng)于維生素C質(zhì)量濃度為0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的血漿樣品，按“1.2.4.1”項(xiàng)下條件處理，以維生素C與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)作縱坐標(biāo)，以血漿維生素C濃度(X)為橫坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘進(jìn)行線性方程回歸分析。

1.2.5.3精密度與回收率試驗(yàn) 取空白血漿及維生素C標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，配置成濃度為1、25、40 μg/mL的質(zhì)量控制(QC)樣品，按“1.2.4.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行操作，每一濃度測(cè)定5個(gè)樣本分析，連續(xù)測(cè)定3 d，用當(dāng)日的標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定QC樣品質(zhì)量濃度，計(jì)算出回收率、日內(nèi)及日間精密度。

1.2.5.4穩(wěn)定性 隨機(jī)選取6例本院健康職工血漿樣本，分別考察維生素C在血漿樣品中放置室溫0、1、2、4、6 h的穩(wěn)定性，按“1.2.4.2”項(xiàng)下條件進(jìn)行操作。

1.2.5.5臨床應(yīng)用 對(duì)選取的123例白血病患者及407名健康志愿者，用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采血，3 000 r/min離心10 min，分離血漿，按“1.2.4.2”項(xiàng)條件進(jìn)行處理，進(jìn)行樣本測(cè)定分析。同時(shí)取本院407名健康志愿者血漿，均未服用維生素C藥物，按同樣的方法進(jìn)行處理測(cè)定。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0對(duì)患者和健康志愿者兩組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1維生素C及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖 見(jiàn)圖1。

圖1 維生素C(A)、內(nèi)標(biāo)L-Ascorbic Acid-1-13C(B)二級(jí)掃描質(zhì)譜圖

2.2方法學(xué)的考察

2.2.1專(zhuān)屬性 維生素C及內(nèi)標(biāo)L-Ascorbic Acid-1-13C的測(cè)定均不受內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，專(zhuān)屬性良好。典型色譜圖見(jiàn)圖2。

注：A表示空白血漿；B表示空白血漿+維生素C+內(nèi)標(biāo)L-Ascorbic Acid-1-13C；C表示患者血漿樣品

圖2維生素C和L-Ascorbic Acid-1-13C色譜圖

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下線 回歸方程為Y=0.098 3X+0.002 78，r=0.994 2。結(jié)果表明，血漿中維生素C質(zhì)量濃度在0.5～50.0 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，其定量下線為0.1 μg/mL。

2.2.3精密度與回收率試驗(yàn) 日內(nèi)及日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，方法回收率在90%～110%，見(jiàn)表1。

表1 精密度及回收率結(jié)果

2.2.4穩(wěn)定性 6例標(biāo)本隨著在室溫放置時(shí)間的延長(zhǎng)，血漿中維生素C的水平逐漸下降，4例標(biāo)本在放置4 h時(shí)維生素C質(zhì)量濃度已降至初始質(zhì)量濃度80%，6 h時(shí)幾乎全部降至80%以下，甚至降至初始質(zhì)量濃度的一半。見(jiàn)圖3。

圖3 維生素C血漿樣本在室溫的穩(wěn)定性(n=6)

2.2.5臨床應(yīng)用 測(cè)得患者及志愿者血漿中維生素C的濃度并分析其分布情況，見(jiàn)表2、圖4、5(比例分布)。80%白血病患者血漿中維生素C濃度在2 μg/mL以下，10%的患者血漿中維生素C濃度在2～<4 μg/mL，僅有10%的患者在4 μg/mL以上；而志愿者血漿中維生素C平均濃度為(8.8±3.0)μg/mL，92%均在4～15 μg/mL范圍內(nèi)，兩組結(jié)果比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 維生素C的質(zhì)量濃度測(cè)定結(jié)果(n=530)

圖4 血漿中維生素C濃度結(jié)果散點(diǎn)圖(n=530)

注：白血病患者體內(nèi)維生素C濃度在4～15 μg/mL為正常，2～<4 μg/mL為水平不足，1～<2 μg/mL為缺乏，低于1 μg/mL為嚴(yán)重不足

圖5白血病患者血漿中維生素C濃度結(jié)果分布圖(n=123)

3 討 論

維生素C具有烯醇式己糖內(nèi)酯立體結(jié)構(gòu)，其烯醇式羥基極易解離出H+，具有有機(jī)酸的性質(zhì)，遇到空氣中氧、熱、光、堿性物質(zhì)及金屬離子存在時(shí)易氧化分解，為增加維生素C的穩(wěn)定性，在溶液的配制及樣品前處理均采用10%的偏磷酸作為溶劑及沉淀劑[17]。目前關(guān)于人血漿中維生素C濃度的測(cè)定，大多采用HPLC法[14-17]，一般容易受到其他物質(zhì)的干擾，且分析時(shí)間較長(zhǎng)(>10 min)，本文建立了一種快速、靈敏、專(zhuān)屬性強(qiáng)的適合測(cè)定人體血漿中維生素C的HPLC-MS/MS方法，分析時(shí)間短(2.0 min)，在內(nèi)標(biāo)的選擇上，比較了L-Ascorbic Acid-1-13C和左旋多巴，綜合考慮保留時(shí)間、響應(yīng)值后，選擇L-Ascorbic Acid-1-13C作為維生素C濃度測(cè)定內(nèi)標(biāo)物。實(shí)驗(yàn)采用室溫放置24 h的血漿作為空白血漿，排除了內(nèi)源性維生素C的干擾[18]，且通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證空白血漿中維生素C水平低于方法的定量下線。為避免維生素C的快速降解，且為了滿足本院臨床標(biāo)本的檢測(cè)，本文僅對(duì)血漿中維生素C在室溫條件下的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，維生素C濃度呈直線下降，建議臨床在采血后盡快送檢(2 h內(nèi))，最長(zhǎng)不超過(guò)4 h，維生素C在其他條件下的穩(wěn)定性還需進(jìn)一步進(jìn)行考察。該方法作為維生素C水平測(cè)定的分析方法，為患者在營(yíng)養(yǎng)學(xué)評(píng)價(jià)及生理病理?xiàng)l件下提供臨床意義。

健康人血漿中維生素C濃度在4～15 μg/mL(正常范圍26～84 μmol/L)，2～<4 μg/mL為維生素C水平不足，低于2 μg/mL為維生素C缺乏，低于1 μg/mL時(shí)有可能引起壞血病[11,17,19-20]。測(cè)定的123份白血病患者樣本中，維生素C水平在2 μg/mL以下的占總數(shù)的80%，僅有12名患者血漿中維生素C水平在4 μg/mL以上，而健康志愿者血漿中維生素C濃度幾乎全在4～15 μg/mL，同時(shí)對(duì)結(jié)果偏低的健康志愿者進(jìn)行了膳食調(diào)查，有志愿者處于哺乳或懷孕階段，推測(cè)這可能是導(dǎo)致維生素C濃度過(guò)低的原因之一，當(dāng)生理狀況發(fā)生改變時(shí)應(yīng)注意維生素C的變化，此外有兩名志愿者有8年以上的吸煙史，有研究稱(chēng)吸煙會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)維生素C的減少[20-21]，所以應(yīng)該減少吸煙。同時(shí)對(duì)530例樣本檢測(cè)結(jié)果做了散點(diǎn)圖(圖4)，圖中顯示志愿者維生素C濃度明顯高于白血病患者(P<0.01)，從而充分說(shuō)明患者體內(nèi)維生素C總體水平偏低，大多數(shù)白血病患者飲食上可能比較單一，導(dǎo)致其體內(nèi)缺乏維生素C。

4 結(jié) 論

已有實(shí)驗(yàn)證明，維生素C可以提高白血病患者的免疫力、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡[12,22]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也為維生素C在白血病治療上的作用提供參考依據(jù)，因此對(duì)于白血病患者應(yīng)適當(dāng)多食用新鮮水果、蔬菜或維生素C制劑來(lái)補(bǔ)充維生素C，為其臨床治療提供幫助。