吡喃糖氧化酶的原核表達及初步實驗應用

王海生，周亞萍，于海燕，郭素梅，曹利民△

(1．常州市武進中醫醫院檢驗科，江蘇常州 213161；2．江蘇艾賽氏生物科技有限公司，江蘇常州 213017)

吡喃糖氧化酶(PROD)是葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶家族的成員，以同源四聚體的形式存在，相對分子質量約為270×103，黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是其重要的輔酶。該酶主要能催化吡喃醛糖2位碳原子發生氧化生成2酮醛糖和過氧化氫[1]。在臨床檢驗中，人們利用其偶聯trinder反應檢測臨床標本中葡萄糖和1,5-脫水葡萄糖醇(1,5-AG)的水平以用于診斷糖尿病[2-3]，但該酶需從國外購買。因此，筆者擬通過基因工程原核表達、純化及鑒定PROD，并配成應用液檢測血糖的水平，分析該法與葡萄糖氧化酶法(GOD法)、已糖激酶法(HK法)檢測血糖診斷糖尿病的效能，以期實現該試劑原料的國產化，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2017年8月至2018年1月由常州市武進中醫醫院內分泌科收治的臨床符合WTO糖尿病診斷標準的2型糖尿病患者30例(空腹血糖>7.0 mmol/L)納入本研究。其中，男16例，女14例，年齡34～74歲，排除有應激、腫瘤、肝損傷、心血管事件、非糖尿病性腎臟疾病等患者。另在常州市武進中醫醫院體檢中心選擇同期20例健康體檢者，男12例，女8例，年齡35～75歲。2組研究對象的年齡、性別等資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。納入研究者對常州市武進中醫醫研究均知情同意，且本研究獲得本院倫理委員會的批準。

1.2儀器與試劑 恒溫培養振蕩器(上海蘇坤實業有限公司)、超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)、UV-9600紫外/可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器有限責任公司)、蛋白電泳儀(美國BIO-RAD公司)、發酵灌(上海鶴禾實業發展有限公司)、日立7080生化分析儀(日本HITACHI公司)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，北京百靈威科技有限公司)，His-Trap FF crude柱、Sephadex G-25 S脫鹽柱(美國GE公司)，咪唑、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、疊氮鈉(Sigma公司)，EDTA、Tris、曲拉通X-100、D-葡萄糖、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)、4-氨基安替比林(4AA)均為上海國藥集團化學試劑有限公司產品，2-羥基-3-間甲苯胺丙磺酸鈉(TOOS，南京旋光科技有限公司)、亞鐵氰化鉀[生工生物工程(上海)股份有限公司]、過氧化物酶(POD，日本Toyobo公司)，HK法和GOD法血糖檢測試劑盒、抗壞血酸氧化酶、BSA(上海羅氏診斷有限公司)。

1.3方法

1.3.1pET15b-PROD重組質粒的構建 通過DNA Tools、ANTHEPROT等生物信息軟件，比較不同種屬的PROD核苷酸同源序列，獲得可溶性好、活性強的PROD核苷酸表達序列，委托上海捷瑞生物工程有限公司合成該核苷酸序列，并構建重組質粒pET15b-PROD。

1.3.2融合蛋白的表達 將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中。轉化子接種至5 mL LB培養基(含氨芐西林50 mg/L)中，37 ℃ 250 r/min振蕩培養12 h。然后，按照1%的比例轉種于250 mL LB培養液(含氨芐西林50 mg/L)中，振蕩培養至A600為0.6～0.8時，向其中加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，20 ℃振蕩培養誘導3 h，離心，收集菌體。

1.3.3融合蛋白的純化 將上述收集的菌體重懸于原培養液1/10體積的裂解液(PBS pH7.4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑，50 μmol/L FAD)中，冰浴超聲破壁10 min，離心，收集上清及沉淀。接著，將該上清液過濾后上樣至預平衡后的His-Trap FF crude柱(平衡液 PBS pH7.4，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L咪唑)，上樣結束后再用10倍柱床體積平衡液平衡，最后用5倍柱床體積洗脫緩沖液(PBS pH7.4，500 mmol/L NaCl，pH8.0，500 mmol/L咪唑)洗脫，每管收集1 mL洗脫液。將收集的上清、沉淀及洗脫液通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定。

1.3.4融合蛋白的脫鹽 將上述收集的洗脫液過濾后，上樣至預平衡后的Sephadex G-25 S脫鹽柱(脫鹽液50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，50 μmol/L FAD)，上樣結束后再用2～3倍柱床體積脫鹽液脫鹽，收集前2.0～2.5 mL含PROD的脫鹽液。

1.3.5融合蛋白活性的檢測 在反應體系為3 mL，100 mmol/L MES，pH6.0中進行，內含131 mmol/L D-葡萄糖，0.2 mmol/L 4AA，0.3 mmol/L TOOS和4 kU/L POD。37 ℃預孵育5 min后，加入適量酶液，在546 nm波長下連續測定2～3 min的吸光度(A)，得到酶的每分鐘A的變化(△A標本)，以不加酶液的反應液為對照，得到空白標本的每分鐘A的變化(△A空白)。定義每分鐘催化葡萄糖生成1 mmol過氧化氫為1個酶活力單位，按照計算公式：酶活性(U/L)=(△A標本-△A空白)×1 890×稀釋倍數，得到PROD的活力。

1.3.6血糖的檢測 先用上述純化的pET15b-PROD融合蛋白配成檢測血糖的應用液，其中，在50 mmol/L pH8.0的TRIS-HCL緩沖液中，添加終濃度為1 mmol/L 4AA，2 kU/L POD，1 kU/L 抗壞血酸氧化酶，0.01% 曲拉通X-100，0.1%疊氮鈉，攪拌均勻即為R1試劑。在50 mmol/L pH8.0的TRIS-HCL緩沖液中，添加終濃度為10 kU/L PROD，2 mmol/L TOOS，0.01%亞鐵氰化鉀，1%BSA、0.75%EDTA，0.1%疊氮鈉，攪拌均勻即為R2試劑。然后在日立7080生化分析儀上分別用本法和羅氏診斷公司的HK法及GOD法血糖檢測試劑盒檢測上述50例納入研究者空腹時采集的臨床血清標本中血糖的水平。

1.4統計學處理 用SPSS15.0軟件進行統計分析。3種方法檢測血糖用于診斷糖尿病的性能采用受試者工作特征曲線(ROC曲線)進行分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1PROD的基因序列 由上海捷瑞生物工程有限公司構建的重組質粒pET15b-PROD經測序可知編碼PROD的基因由1 869個堿基組成，表達623個氨基酸,部分測序圖見圖1。

圖1 PROD部分測序結果

2.2pET15b-PROD融合蛋白的表達 與空質粒和重組質粒誘導前相比較，含有pET15b-PROD融合基因的表達菌BL21經IPTG誘導3 h后在相對分子質量68×103處有一條明顯的蛋白條帶。該菌經超聲離心后在沉淀中此處的條帶很弱，而在上清中較濃，且上清液經Ni柱親和純化后此處的蛋白條帶純度達90%以上，見圖2。

2.3pET15b-PROD融合蛋白的活性 在產生H2O2的反應中，通過檢測得到本批每克純化后的凍干粉中PROD活性超過60×103個單位。

2.43種方法檢測血糖診斷糖尿病的ROC曲線分析 通過繪制ROC曲線可知：GOD法、PROD法及HK法檢測血糖診斷糖尿病的ROC曲線下面積分別為0.994、0.995、0.992(均P=0.000)。根據約登指數得知它們檢測空腹血糖診斷糖尿病的最佳臨界點分別為7.16、7.11、7.06 mmol/L。

注：M為蛋白質相對分子質量標準帶；1為空白質粒；2為重組質粒誘導前；3為重組質粒誘導后；4為沉淀；5為上清；6為純化的蛋白

圖2重組質粒pET15b-PROD原核表達產物SDS-PAGE的電泳分析

3 討 論

PROD作為一種氧化還原酶型生物催化劑，在其催化的還原反應中，吡喃醛糖等底物還原FAD形成FADH2和2-酮醛糖，而在其催化的氧化反應中，氧等電子受體接受FADH2的氫產生過氧化氫，但該氧化反應受到pH值的控制，當pH值小于7.6時易于形成C4α-過氧化氫黃素蛋白中間體進而產生過氧化氫[4]。在其還原性底物中，葡萄糖是其最適底物，其Km值為0.83～3.1 mmol/L[1]，且PROD能同時作用于α-和β-D-葡萄糖，而GOD和HK只能作用于β-D-葡萄糖，因此，PROD無需加入變旋酶即可測定標本中葡萄糖水平。除了葡萄糖外，PROD還有一些其他的還原性底物如1,5-AG，半乳糖等。其中，1,5-AG能反映糖尿病患者近期(1 d至1周)的血糖水平，因此，利用PROD檢測葡萄糖水平可實施對糖尿病患者血糖水平的短期監控[5-6]。在其氧化性電子受體中，氧是便宜、干凈的電子受體，氧接受電子后生成的過氧化氫，一方面，對木質纖維素的降解有著重要作用，另一方面，人們可利用該反應制成生物傳感器或生物燃料電池[7-10]。此外，PROD除了催化吡喃醛糖C2位氧化，還可催化其C3位氧化，制備一些稀有的糖類如塔格糖等[11]。正由于該酶在臨床檢驗、生物工程及有機化學合成等方面的應用，近年來越來越受到重視。

目前，PROD可通過真菌類微生物如Trametes multicolor提取獲得，但其產量低、純化工藝繁雜，因此，通過基因工程大量獲取高純度的PROD仍是首選。為此，構建優良的PROD生產菌株尤為重要。參考相關文獻，本研究所表達的PROD由623個氨基酸組成。其中，167號組氨酸通過N3與FAD的C8位甲基共價連接，由452～457氨基酸殘基構成的環是葡萄糖等底物結合位點[1]，166號蘇氨酸、448號谷胺酰胺、545號和547號亮氨酸及593號天冬酰胺都與氧的反應性密切相關[12]，另外，593號天冬酰胺也與PROD對底物的C2氧化功能有關[13]。在誘導表達時，通常低溫能增加可溶性蛋白的表達，減少包涵體的形成[14]。因此，本課題組直接選擇20 ℃誘導表達，SDS-PAGE電泳顯示，PROD主要以可溶性蛋白表達為主，表達量達到200 mg/L，這避免了蛋白以包涵體出現而活性不佳的情況。因融合蛋白帶有6個His標簽，因此，本課題組采用Ni2+親和層析柱親和純化蛋白，在純化過程中，發現含500 mmol/L咪唑的洗脫液能很好地去除雜蛋白。此外，由于FAD是PROD的輔酶，對其催化功能至關重要[1]，因此，本課題組在整個純化和脫鹽過程中均通過添加FAD保證其良好的活性，收獲的凍干粉中每克PROD活性超過60×103個單位，遠高于其他試劑原料商每克10×103個單位，這是由于本課題組在整個生產過程中實驗條件得到了很好的優化。用此高活性蛋白配制的應用液和GOD法及HK法血糖檢測試劑盒檢測血糖，其ROC曲線下的面積均大于0.99，根據約登指數得到的診斷糖尿病的空腹血糖的臨界值均與WTO確診糖尿病的空腹血糖值7.0 mmol/L相接近，這表明本法與GOD法和HK法一樣，在檢測血糖診斷糖尿病方面具有很好的診斷效能，可用于血糖的檢測。同時，也說明該融合蛋白帶有的His標簽并未影響其功能[15]。后期該菌株經100升發酵罐放大培養得到約14克活性蛋白，故可批量生產以滿足試劑廠商原料要求。

4 結 論

本研究生產的pET15b-PROD融合蛋白可溶、純度優、活性強、產量高。該法測定血糖診斷糖尿病時，與GOD法和HK法一樣，具有很高的準確性，可用于血糖的檢測。在此研究之上可進一步優化條件使之應用于臨床標本中1,5-AG的檢測。