長鏈非編碼RNA調控肝癌發生發展相關細胞信號通路的研究進展

唐佳月 林 勇

高通量RNA測序技術的發展使得大量長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)基因被發現。既往認知中，大多數lncRNA是沒有任何功能的隨機轉錄產物；然而近年來越來越多的證據表明，lncRNA參與諸多病理生理過程，是細胞中重要的功能分子。以下對肝癌相關lncRNA的功能和分子機制進行概述，探討lncRNA在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)中Wnt、信號轉導與轉錄活化因子3(STAT3)、上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal tramsition，EMT)、NF-κB這4種細胞信號通路發揮的重要調控作用。了解lncRNA在肝癌發生中發揮作用的途徑，以期為肝癌的臨床診斷和治療提供幫助。

1 lncRNA功能概述

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)以200個堿基為限分為短鏈非編碼RNA和lncRNA兩大類，兩者的共同特點為均無蛋白質編碼能力[1]。與作為蛋白質合成模板的mRNA相似，lncRNA的作用發揮需經過剪接、5’帽子、聚腺苷酸化、RNA編輯等RNA加工步驟，在腫瘤和胚胎發育中具備差異調控的特點。不同細胞成分的lncRNA通常發揮不同的生物學功能。細胞核中lncRNA可作為染色質修飾復合體[2]或轉錄因子的向導[3]來發揮作用；細胞質中的lncRNA則多在蛋白質水平進行調控，通過直接調節mRNA穩定性[4]或作為競爭內源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)成為微RNA(micro RNA, miRNA)的海綿分子，吸附相關miRNA并調控其下游信號通路[5]。

已有研究[1]結果表明，lncRNA在HCC的發生、轉移、侵襲過程中發揮重要作用。根據在腫瘤發生和發展過程中的生物學功能，以及正向或負向調控作用，lncRNA可分為致癌lncRNA和抑癌lncRNA，分別通過調控Wnt、STAT3、EMT等腫瘤相關信號通路發揮促癌或抑癌作用。

2 不同信號通路相關lncRNA

2.1 Wnt信號通路相關lncRNA Wnt信號通路是肝癌發生和發展中的關鍵信號通路之一。該通路在進化上高度保守，在HCC發生和發展過程中被激活并決定細胞命運[6]。Wnt信號通路激活的過程由WNT5A等可溶性Wnt蛋白啟動，上述蛋白質與Frizzled家族的膜結合G蛋白偶聯受體(G protein-coupled receptor, GPCR)結合后，導致由軸蛋白(AXIN)、結腸腺瘤性息肉病基因蛋白(APC)、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)、糖原合成酶激酶3(glycogenkinase 3，GSK3)和酪蛋白激酶1α(casein kinase 1α，CK1α)組成的破壞復合體失活，對β-連環蛋白(β-catenin)靶向泛素化的作用消失，β-catenin降解減少，在細胞質中沉積增多并轉位至細胞核，隨后作為轉錄因子T淋巴細胞因子(T-cell factor，TCF)/淋巴增強因子(lymphoid enhancer factor，LEF)的反式作用因子激活下游靶基因的轉錄[7]。β-catenin由CTNNB1基因編碼，而CTNNB1、AXIN1、APC均是HCC中突變頻繁的蛋白質編碼基因，CTNNB1基因突變最常發生于對β-catenin降解起重要作用的結構域，可導致β-catenin的聚集；AXIN1基因突變可使AXIN1失活，破壞復合體的活性，從而導致β-catenin活性增高[8-9]。此外，GSK3和CK1α功能受到抑制也可引起細胞質中β-catenin增多。

lncRNA可通過調控CTNNB1、APC、GSK3等多個Wnt通路重要靶點在HCC的發生和發展中發揮作用(圖1)。抗分化lncRNA(lncRNA-DANCR)、泛素折疊修飾結合酶1相關lncRNA(lnc-UFC1)、β-catenin相關lncRNA(lnc-beta-catm)均在HCC細胞中高表達，提示預后不良[10-13]；它們的共同特點是均作用在β-catenin環節。在HCC細胞中過表達lncRNA-DANCR可提高成瘤能力，促進其在小鼠肝臟和肺中定植；其促癌的作用主要通過競爭性結合miRNA-214、miRNA-320a、miRNA-199a，阻斷上述miRNA對CTNNB1基因的沉默作用，導致CTNNB1蛋白質水平升高，進而激活Wnt信號通路[10]。lnc-UFC1對CTNNB1蛋白質的調控作用則通過募集RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)至CTNNB1 mRNA，防止其發生降解；此外，lnc-UFC1還可促進CTNNB1蛋白質由細胞質向細胞核易位[11]。與前述兩個lncRNA不同，lnc-beta-catm在HCC中的作用機制是穩定CTNNB1蛋白。lnc-beta-catm與組蛋白-賴氨酸N-甲基轉移酶(enhancer of zeste 2 polycomb repressive complex 2 subunit，EZH2)結合，將其募集至CTNNB1并甲基化CTNNB1蛋白的賴氨酸殘基，通過含E3泛素蛋白連接酶的β-轉導素重復序列(beta-transducin repeat containing E3 ubiquitin protein ligase,BTRC)抑制其泛素化，從而激活Wnt通路[12]。

圖1 HCC中lncRNA對Wnt信號通路的調控作用

Wnt信號途徑激活lncRNA(lnc-TCF7)和結腸腺瘤性息肉病基因相關lncRNA(lnc-APC)的作用靶點分別為TCF7和APC。lnc-TCF7是一種在肝腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)中高表達的lncRNA。其與轉錄因子7(transcription factor 7，TCF7)啟動子區域的DNA結合，招募染色質重建復合體SWI/SNF(Yeast mating-type switching/sucrose non-fermenting)至TCF7啟動子中，觸發TCF7表達，促進Wnt通路下游基因活性[2]。lnc-APC在肝腫瘤起始細胞(TIC)中高表達、過表達或沉默lnc-APC可促進或抑制TIC成瘤能力；其作用機制為招募EZH2至APC啟動子，抑制APC的轉錄[10]。

GSK3也是lncRNA在Wnt信號通路的重要元件，lncRNA-核內小RNA宿主基因5(lnc-SNHG5)、lncRNA-間充質干細胞上調因子(lnc-MUF)均作用于該靶點。lnc-SNHG5在HCC中高表達，與HCC預后呈正相關，可判斷治療效果。上調SNHG5可抑制肝癌細胞凋亡，促進肝癌細胞增殖、侵襲和遷移；下調SNHG5可誘導肝癌細胞凋亡，抑制肝癌細胞的增殖和轉移。SNHG5的作用機制：作為ceRNA競爭性結合miRNA-26a-5p調控GSK 3β的表達，并激活Wnt信號通路，誘導EMT[14]。lnc-MUF可促進肝癌細胞成瘤和侵襲能力。其作用機制：與Wnt通路上游元件膜聯蛋白A2(ANXA2)相互作用，阻礙GSK 3β/CTNNB1復合體形成，促進CTNNB1蛋白質蓄積。此外，lnc-MUF還可作為miRNA-34a的ceRNA，調節轉錄因子SNAIL1活性[15]。

2.2 STAT3信號通路相關lncRNA Janus激酶(JAK)-STAT信號通路與肝癌的發生和發展密切相關。該通路由IL-6家族細胞因子受體、GPCR或toll樣受體(TLR)等誘導。各種原因導致JAK2激活后，磷酸化STAT3形成功能活性二聚體，轉位至細胞核，可引起促生存基因、炎性反應因子相關基因、EMT和CSC相關基因的轉錄增加[16]。在JAK-STAT通路中，STAT3相關ncRNA最多，與lncRNA相關性也最為密切[17]。STAT3可調控許多直接參與HCC進展及其早期階段的基因[18-19]。

作用于STAT3信號通路的促癌lncRNA包括lncRNA-SRY盒轉錄因子4(lnc-Sox4)、轉化生長因子β活化的lncRNA(lnc-ATB)、lncRNA-尿路上皮癌相關基因1(lnc-UCA1)等，抑癌lncRNA則包括肝腫瘤干細胞中下調的lncRNA(lncRNA-DILC)等。lnc-Sox4可直接與STAT3結合，將STAT3招募至SOX4的啟動子區域，從而驅動SOX4及其下游基因表達[3]。lnc-ATB通過RNA-雙鏈形成機制與IL-11 mRNA相結合，增加IL-11 mRNA的穩定性，促進IL-11自分泌，激活IL 11/STAT3信號通路，經不依賴于EMT的途徑增強HCC的定植能力[4]。lnc-UCA1可激活NF-κB/STAT3信號，促進肝腫瘤細胞惡性轉化和增強其增殖的能力[20]。而lncRNA-DILC是一種與HCC早期復發和生存時間縮短相關的抑癌lncRNA，抑制lncRNA-DILC顯著增強肝CSC的擴增，促進肝癌發生和發展；而外源表達DILC可顯著抑制該過程。lncRNA-DILC的抑癌作用是通過干擾NF-κB介導的IL-6表達，從而抑制IL-6/STAT3自分泌信號實現[21]。

2.3 調控EMT的lncRNA EMT是指在生理或病理情況下，上皮細胞失去極性，黏附能力降低，而遷移、侵襲能力增強，逐漸轉變為間充質細胞的過程。其特征為Snail家族轉錄抑制因子1(SNAI1)、Twist和E盒結合鋅指蛋白(ZEB)1/2等轉錄因子活化，波形蛋白(vimentin, Vim)、N-鈣黏蛋白等間質相關蛋白質的表達上調，E-鈣黏蛋白等細胞間連接蛋白的蛋白質表達下調[22]。HCC細胞的侵襲性、移行性與EMT密切相關，是HCC轉移和侵襲發生的重要機制[23]。

lncRNA調控EMT信號通路主要是作為EMT關鍵元件相關miRNA的ceRNA或調控EMT相關轉錄因子活化實現。有研究[24]結果表明，缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF1α)與EMT直接相關，并通過腫瘤血管的形成間接參與腫瘤的轉移過程。通過作用于HIF1α調控EMT的lncRNA包括重編程調控lncRNA(lnc-ROR)、腫瘤低表達lncRNA(lnc-LET)、CPS1內含子轉錄本1(CPS1-IT)等。其中lnc-ROR為促癌lncRNA，lnc-LET、CPS1-IT為抑癌lncRNA。lnc-ROR是一種應激反應性lncRNA，在HCC組織中的表達上調，尤其在缺氧條件下HCC來源的細胞外囊泡內高度富集。下調lnc-ROR可升高miRNA-145表達水平，降低HIF1α表達水平，抑制EMT和腫瘤細胞活力[25]。lnc-LET在HCC組織中的表達明顯下調，與IL增強劑結合因子3(ILF3)/核因子90(NF90)結合并導致其降解，負向調控HIF1α信號，抑制HCC轉移[26]。CPS1-IT也是HCC組織中表達下調的lncRNA。其作用機制為影響熱休克蛋白90(heat shock protein, HSP90)和HIF1α復合物的形成，降低HIF1α活性，導致重要的間質細胞標志物Vim、SNAI1、TWIST表達下調，抑制EMT[27]。

肝癌高表達lncRNA(lnc-HULC)、lnc-ATB、lncRNA-牛磺酸上調基因1(lnc-TUG1)、位于ZEB1反義鏈的lncRNA(lnc-ZEB1-AS1)在EMT通路中的作用靶點均為ZEB1。lnc-HULC和lnc-ATB可作為ZEB1上游miRNA-200a的ceRNA，lnc-TUG1可作為ZEB1上游miRNA-142-3p的ceRNA發揮作用；而lnc-ZEB1-AS1則直接影響ZEB1轉錄。lnc-HULC是較早在HCC中發現的一種促癌lncRNA，在HCC中高表達。lnc-HULC可競爭結合miRNA-200a，激活miRNA-200a靶基因ZEB1，誘導EMT，進而促進腫瘤的發展和轉移；下調HCC細胞和組織中的lnc-HULC，可顯著增高miRNA-200a的表達水平，降低ZEB1 mRNA表達水平，抑制EMT進程[28]。lnc-ATB在HCC和門靜脈癌栓(PVTT)中的表達上調；下調lnc-ATB后，可使miRNA-200a表達水平升高，ZEB1表達水平降低，抑制HCC發生轉移[12，29]。在HCC組織中，lnc-TUG1水平與miRNA-142-3p水平呈負相關，下調TUG1可顯著降低ZEB1和EMT相關蛋白的蛋白質表達水平，抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力[30]。lnc-ZEB1-AS1與HCC的轉移相關，在轉移性肝癌組織中lnc-ZEB1-AS1高表達。該lncRNA與ZEB1共享一個雙向啟動子，可正向調控ZEB1表達，促進EMT和HCC轉移[31]。超級增強子相關lncRNA(lnc-HCCL5)是一種超級增強子驅動的細胞質lncRNA，在HCC組織中上調，可與ZEB1形成正反饋，促進SNAI1、Slug和Twist1等間質標志物表達，加速HCC細胞的EMT進程[32]。

2.4 NF-κB信號通路相關lncRNA NF-κB通路是一個以基因轉錄調節為導向的生物學通路。在正常機體中，NF-κB與p50/p65形成二聚體并與NF-κB抑制蛋白(inhibitor proteins of NF-κB, IκB)相結合，以靜息狀態存在于細胞質中。當受到IL-6、IL-1、TNF-α等細胞因子的刺激時，通過IκB激酶的誘導，NF-κB二聚體被釋放并進入細胞核，激活腫瘤侵襲、轉移等相關基因轉錄。

lncRNA人肺腺癌轉移相關轉錄本1(lnc-MALAT1)在HCC的腫瘤組織中上調。在脂多糖(LPS)刺激下，MALAT1下調，抑制HCC細胞的增殖和侵襲；敲除MALAT1可顯著抑制LPS誘導的促炎介質IL-6和IL-8在HCC細胞中的表達，而過表達MALAT1可使其恢復。關于機制研究[33]的結果表明，MALAT1招募Brahma相關基因1(BRG1)至IL-6和IL-8啟動子區，從而促進NF-κB誘導炎性因子的表達。有研究[34]發現，MALAT可作為miRNA-195的ceRNA，進而調控其下游磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,AKT)和JAK/STAT通路。上述結果提示，lncRNA可能通過多種途徑和功能調控HCC的發展進程。lncRNA 00607在HCC組織中的表達水平下調，其低表達預示著HCC患者的預后較差。lncRNA 00607調控HCC的機制為結合p65啟動子區域，抑制p65轉錄，從而升高p53水平。因此，靶向TNF-α/IL-6-lncRNA 00607-NF-κBp65/p53信號通路可能是HCC化學治療的新途徑[35]。

3 lncRNA在HCC診斷和治療中的價值

一項包含16篇研究共4 842例樣本的meta分析評估了lncRNA在HCC中的診斷價值。該研究[36]中，lncRNA診斷HCC的合并靈敏度、特異度分別為87.0%和82.9%，AUC為0.915；研究結果提示，一些異常表達的lncRNA，尤其是血清和血漿中的多種lncRNA可作為潛在的標志物，在HCC中具有較高的診斷準確性，而不同標志物的聯合檢測可進一步提高HCC的診斷準確性。

大量研究結果表明，lncRNA在預測HCC腫瘤復發和患者生存期中發揮重要作用，生存分析顯示lncRNA-DANCR、lnc-UFC1、lnc-SNHG5、lncRNA-DILC的表達水平與復發時間和總生存期顯著相關，也是HCC患者復發和生存的獨立危險因素，提示lncRNA可能具有判斷HCC患者預后的潛能。

靶向特定lncRNA進行針對性的增強或阻斷是HCC治療一個具有潛力的新領域，已受到人們的重視，目前有研究提示lncRNA可作為靶向藥物治療HCC，如HCC組織中lnc-MALAT1的表達水平升高，沉默lnc-MALAT1可抑制HCC異種移植物的生長，并相應地抑制促炎因子在HCC組織中的表達，提示MALAT1靶向治療可能是HCC可探索的一種臨床治療方法[33]。然而，將lncRNA作為靶向藥物治療HCC尚不成熟，僅限于理論研究階段，仍需進一步臨床試驗證實lncRNA可作為HCC治療的靶點。耐藥是HCC臨床治療中最棘手的問題之一，lncRNA可作為克服耐藥性的潛在靶點而在HCC治療中發揮作用。lncRNA 00607在HCC中表達下調，其過表達可降低體內和體外HCC細胞的增殖，增強細胞凋亡，提高對INF-α、5-氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素治療敏感性[35]。上述研究結果提示，lncRNA聯合化學治療可能是治療晚期HCC的有效策略。

4 小結和展望

lncRNA通過多種方式調控Wnt、STAT3和EMT相關信號通路，參與HCC的發生、轉移和侵襲過程。隨著對lncRNA認識的加深，更多lncRNA調控HCC相關信號通路的研究將會促進對腫瘤發生機制研究的深化，同時可能為腫瘤的防治提供新方法。