梔子苷對潰瘍性結腸炎模型大鼠的治療作用及其機制

步 楠 范彥秋

潰瘍性結腸炎(UC)是臨床常見的炎癥性腸病。UC的發病機制目前仍未完全闡明，臨床上也缺乏根治UC的藥物。腸黏膜內慢性非特異性炎性反應的激活是UC的重要病理特征，細胞內的多種炎性信號通路在UC的發病過程中呈過度激活狀態。NF-κB是Toll樣受體(TRL)下游的重要轉錄因子，激活后轉位進入細胞核并促進多種炎癥基因的表達和炎性反應的激活；NOD樣受體蛋白3(NLRP3)是(NLRP3)炎性小體的重要組成部分，活化后能夠招募細胞內的半胱天冬酶-1(caspase-1)并使無活性的促炎細胞因子前體向有活性的促炎細胞因子成熟體轉化，進而促進炎性反應的激活。現有的研究[1-3]結果表明，NF-κB通路和NLRP3炎性小體在UC腸黏膜中呈過度激活的狀態。因此，抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小體也被認為是治療UC的潛在靶點。

梔子苷是梔子的主要活性成分，屬于環烯醚萜苷類化合物，已經在類風濕關節炎、心肌梗死、腦梗死等動物模型中被證實能夠發揮免疫調節、抗炎、抗氧化等生物學作用[4-6]。本研究將梔子苷用于UC模型大鼠的治療，探討梔子苷治療UC的價值及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠共60只，體重200～250 g，購自黑龍江中醫藥大學，許可證號SCXK(黑)2016-004，由佳木斯醫學院實驗動物中心飼養。

1.1.2 實驗試劑 梔子苷、三硝基苯磺酸(TNBS)、NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸銨(PDTC)、NLRP3炎性小體抑制劑VX765購自美國Sigma公司；ELISA試劑盒購自上海西唐公司，紫外線比色法試劑盒購自南京建成公司，超純RNA提取試劑盒、SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑購自北京康為世紀公司，閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)、閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白-1(Claudin-1)、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的單克隆抗體購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模和給藥 按照隨機數字表將SD大鼠分為對照組、模型組、梔子苷組、PDTC組、VX765組，每組12只。模型組、梔子苷組、PDTC組、VX765組采用TNBS灌腸的方式建立UC模型：將無水乙醇與5%的TNBS按1∶1比例混合，把直徑2 mm的聚乙烯管經大鼠肛門插入8 cm，按照TNBS 100 mg/kg的劑量將混合液經聚乙烯管灌入；對照組給予等劑量0.9%氯化鈉溶液灌腸。灌腸后24 h，開始給藥。參照Xu等[7]研究的方法，梔子苷組予梔子苷(50 mg/kg)灌胃，1次/d；PDTC組給予PDTC (5 mg/kg)腹腔內注射，1次/d；VX765組給予VX765 (50 mg/kg)腹腔內注射，1次/d。

1.2.2 體重和攝食量的觀察 干預當天至干預第14天，每天稱量大鼠的體重和食物質量，計算攝食量。

1.2.3 腸黏膜組織病理學評分 處死大鼠后解剖結腸組織，用4%甲醛溶液固定后常規石蠟包埋，制作石蠟切片后進行H-E染色，置于高倍光學顯微鏡下觀察腸黏膜的組織形態并進行評分(0～5分，0分為無損傷，5分為重度糜爛、嚴重充血水腫。得分越高，病變越重)。

1.2.4 血清中二胺氧化酶(DAO)、D-乳酸含量的測定 處死大鼠后留取外周血5 mL，靜置后離心分離血清，應用紫外比色法試劑盒測定DAO含量，應用ELISA試劑盒測定D-乳酸含量。

1.2.5 細胞因子含量的測定 處死大鼠后解剖結腸組織，加入磷酸鹽緩沖液后在液氮上研磨，研磨液以3 000×g離心后棄去沉淀、保留上清液，應用ELISA試劑盒測定上清液中TNF-α、IL-1、IL-18含量。

1.2.6 細胞因子mRNA表達量的測定 處死大鼠后解剖結腸組織，應用超純RNA提取試劑盒提取組織中的RNA，應用SuperRTcDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA；取cDNA 1 μL、UltraSYBR Mixture試劑10 μL、0.2 μmol/L的引物混合液0.8 μL、去離子水8.2 μL混合，在熒光定量PCR儀上進行反應，得到反應曲線和相應的循環閾值(Ct)，參照公式2-△△Ct計算TNF-α、IL-1、IL-18的mRNA表達量。

1.2.7 Western印跡法檢測蛋白質的表達量 處死大鼠后解剖結腸組織，用蛋白裂解液提取總蛋白質后測定總蛋白質含量，取50 μg總蛋白質進行Western印跡法檢測，行SDS-PAGE和轉膜，將蛋白質樣本轉移至硝酸纖維素(NC)膜后用5%脫脂牛奶封閉NC膜2 h，加入1∶1 000稀釋的ZO-1、Occludin、Claudin-1、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1單克隆抗體在4 ℃孵育過夜；第2天取出NC膜，用TBST緩沖液洗滌3次后孵育HRP第二抗體1 h，TBST緩沖液洗滌3次并加入顯影液，在化學發光成像系統中曝光得到蛋白質條帶，應用Image-J軟件掃描蛋白質條帶灰度值，計算ZO-1、Occludin、Claudin-1、NF-κB p65、NLRP3、caspase-1灰度值與β-actin灰度值的比值作為相應分子的蛋白質表達量。

2 結 果

2.1 各組大鼠的體重和攝食量 造模前各組大鼠的體重和攝食量的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。造模后至實驗結束，對照組大鼠體重保持平穩，略有增加；攝食量逐日增加。模型組、梔子苷組、PDTC組和VX765組大鼠體重下降，攝食量增加緩慢。第6、8、14天，模型組大鼠的體重、攝食量均明顯低于對照組(P值均<0.05)；第8、14天，梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠的體重和攝食量均明顯高于模型組(P值均<0.05)。見表1。

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.2 各組大鼠腸黏膜的H-E染色和組織病理學評分 對照組、模型組、梔子苷組、PDTC組和VX765組大鼠的組織病理學評分分別為0.76±0.09、3.94±0.62、1.76±0.26、1.95±0.32、1.88±0.39，組間比較差異有統計學意義(F=19.224，P<0.01)，進一步兩兩比較發現，模型組明顯高于對照組(P<0.05)；梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠的組織病理學評分均明顯低于模型組(P值均<0.05)。見圖1。

A 對照組 B 模型組 C 梔子苷組 D PDTC組 E VX765組圖1 各組大鼠腸黏膜H-E染色比較 ×100

2.3 各組大鼠腸黏膜內炎性細胞因子的含量及其mRNA表達水平 模型組大鼠腸黏膜內TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質含量及其mRNA表達水平均明顯高于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組、PDTC組大鼠腸黏膜內TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質含量及其mRNA表達水平均明顯低于模型組(P值均<0.05)；VX765組大鼠腸黏膜內TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質含量和TNF-α的mRNA表達水平均明顯低于模型組(P值均<0.05)，IL-1、IL-18的mRNA表達水平與模型組的差異無統計學意義(P值均>0.05)。見表2。

組別TNF-α蛋白質(μg/L)mRNAIL-1蛋白質(μg/L)mRNAIL-18蛋白質(μg/L)mRNA對照2.55±0.451.00±0.14164.48±22.351.00±0.18121.37±23.411.00±0.17模型8.23±1.27①2.51±0.45①452.32±68.75①2.88±0.62①321.76±52.35①2.24±0.46①梔子苷3.88±0.62②1.67±0.27②249.95±52.23②1.78±0.28②204.56±32.4②1.50±0.24②PDTC4.13±0.59②1.52±0.19②228.74±47.51②1.61±0.22②212.52±27.58②1.46±0.19②VX7653.73±0.51②1.58±0.22②235.37±42.68②2.72±0.39201.36±32.19②2.15±0.38F16.8448.94813.74411.38218.1287.228P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

與對照組比較：①P<0.05。與模型組比較：②P<0.05

2.4 血清中DAO、D-乳酸的含量 模型組大鼠血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯高于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯低于模型組(P值均<0.05)。見表3。

組別DAO(U/L)D-乳酸(mg/L)對照6.71±0.946.12±0.89模型8.94±1.25①27.62±4.42①梔子苷7.12±0.89②10.32±1.85②PDTC6.88±0.97②11.67±1.77②VX7656.96±0.87②10.16±1.46②F10.21017.169P<0.001<0.001

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

2.5 腸黏膜內連接蛋白的蛋白質表達量 模型組大鼠腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質表達量均明顯低于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組、PDTC組、VX765組大鼠腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質表達量均明顯高于模型組(P值均<0.05)。見圖2、表4。

2.6 腸黏膜內NF-κB通路分子和NLRP3的蛋白質表達量 模型組大鼠腸黏膜內NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的蛋白質表達量均明顯高于對照組(P值均<0.05)。梔子苷組大鼠腸黏膜內NF-κB p65、NLRP3、caspase-1的蛋白質表達量均明顯低于模型組(P值均<0.05)；PDTC組腸黏膜內NF-κB p65的蛋白質表達量低于模型組(P<0.05)，NLRP3和Caspase-1的蛋白質表達量與模型組的差異均無統計學意義(P值均>0.05)；VX765組腸黏膜內NF-κB p65的蛋白表達量與模型組的差異無統計學意義 (P>0.05)， NLRP3和Caspase-1的蛋白質表達量均明顯低于模型組(P值均>0.05)。見圖3、表5。

1 對照組 2 模型組 3 梔子苷組 4 PDTC組 5 VX765組 A ZO-1表達 B Occludin表達 C Claudin-1表達圖2 腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白質表達情況

表4 各組大鼠腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1蛋白質表達量的比較

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

1 對照組 2 模型組 3 梔子苷組 4 PDTC組 5 VX765組 A NF-κB蛋白質表達 B NLRP3蛋白質表達 C caspase-1蛋白質表達圖3 腸黏膜內NF-κB p65、NLRP3、caspase-1蛋白質表達情況

組別NF-κB p65NLRP3caspase-1對照1.00±0.241.00±0.251.00±0.28模型2.25±0.42①3.41±0.62①4.22±0.62①梔子苷1.56±0.25②2.58±0.52②2.11±0.32②PDTC1.42±0.25②3.32±0.523.89±0.62VX7652.31±0.452.77±0.46②2.26±0.52②F12.87518.92823.482P<0.001<0.001<0.001

與對照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

3 討 論

UC是與自身免疫應答紊亂相關的非特異性炎癥性腸病，腸黏膜內炎性反應的持續激活是疾病主要的病理特征[8-9]。目前，臨床上仍缺乏根治UC的有效藥物，腸黏膜炎性反應激活所引起的臨床癥狀會反復發生。梔子苷是從梔子中提取得到的環烯醚萜苷類化合物，具有免疫調節、抗炎、抗氧化等生物學作用。在自身免疫性疾病類風濕關節炎的動物模型中，梔子苷被證實能夠調節免疫功能，改善病情[10]。為了明確梔子苷治療UC的價值，本研究首先通過TNBS灌腸的方式建立了UC大鼠模型，發現模型組大鼠的腸黏膜發生了明顯損害，損傷程度和病變范圍均達到了3～4分，且模型組大鼠的體重和攝食量均明顯低于對照組，提示TNBS灌腸成功建立了UC大鼠模型。在TNBS造模的基礎上，予大鼠梔子苷灌胃干預后發現，梔子苷組大鼠的組織病理學評分明顯低于模型組，體重和攝食量均明顯高于模型組；提示梔子苷治療能夠減輕UC模型大鼠的腸黏膜損害，改善UC模型大鼠的體重和攝食情況，在UC的治療中發揮了積極的作用。

腸黏膜內慢性炎性反應的持續激活是UC重要的病理表現，炎性細胞因子的高表達和大量釋放是炎性反應激活的特征。TNF-α、IL-1、IL-18是具有強大促炎活性的細胞因子，由單核巨噬細胞、淋巴細胞等分泌，能夠在腸黏膜內介導炎性反應的級聯放大并引起腸黏膜病理損害[11-12]。本研究結果顯示：模型組大鼠腸黏膜內TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質及其mRNA表達量均明顯高于對照組，梔子苷組大鼠腸黏膜內TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質及其mRNA表達量均明顯低于模型組。提示UC模型大鼠腸黏膜內多種炎性細胞因子大量表達和分泌，梔子苷能有效抑制UC模型大鼠腸黏膜內炎性細胞因子的表達和分泌，具有抑炎活性。慢性炎性反應會直接造成腸黏膜屏障損傷，腸黏膜上皮細胞內的DAO大量釋放進入血液循環，腸道菌群也發生易位并產生大量D-乳酸進入血液循環[13]，參與腸黏膜上皮間緊密連接的蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1等表達受到抑制[14-15]。本研究對上述腸黏膜屏障功能相關指標的分析顯示：模型組大鼠血清中DAO和D-乳酸的含量均明顯高于對照組，腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達均明顯低于對照組；而梔子苷組大鼠血清中DAO和D-乳酸的含量明顯低于模型組，腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1的表達明顯高于模型組。這一結果表明UC模型大鼠的腸黏膜屏障受損，梔子苷能夠減輕UC模型大鼠腸黏膜的受損程度。

NF-κB通路和NLRP3炎性小體是細胞內調控炎性反應的重要機制。在生理條件下，NF-κB與相應的抑制分子(IκB)結合并處于無活性狀態；在外界病理因素的刺激下，細胞外信號向細胞內傳遞引起NF-κB與IκB解離并發生活化。活化的NF-κB向細胞核內轉移后能夠結合TNF-α、IL-1、IL-18基因的啟動子區域，進而通過基因表達產物來介導炎性反應[16-17]。本研究對腸黏膜內NF-κB表達的分析顯示：模型組大鼠腸黏膜內NF-κB的表達水平明顯高于對照組，梔子苷組大鼠腸黏膜內NF-κB的表達水平明顯低于模型組，提示腸黏膜內NF-κB的表達在UC發病過程中明顯增多，梔子苷干預能夠通過抑制腸黏膜內NF-κB的活化，到抑炎作用。為了進一步驗證NF-κB在UC發病及其在梔子苷治療中的作用，本研究使用NF-κB的抑制劑PDTC干預UC模型大鼠，觀察到PDTC組大鼠的組織病理學評分，腸黏膜內TNF-α、IL-1、IL-18的蛋白質及其mRNA表達量，血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯低于模型組，體重，攝食量，腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質表達水平均明顯高于模型組，而與梔子苷組的差異無統計學意義。這一結果表明NF-κB抑制劑能夠減輕UC模型大鼠腸黏膜損傷，降低多種炎性細胞因子的表達和分泌。

NF-κB進入細胞核后調節TNF-α、IL-1、IL-18的表達，TNF-α基因的表達產物能夠直接發揮促炎作用，而IL-1、IL-18基因的表達產物為無活性前體，需要在NLRP3炎性小體的進一步介導下裂解為有活性的成熟體并發揮促炎作用。caspase-1亦是NLRP3炎性小體的重要組成部分，NLRP3表達的上調能夠活化caspase-1，活化的caspase-1將IL-1和IL-18的無活性前體裂解為有促炎活性的成熟體，進而介導炎性反應[18-19]。本研究對NLRP3炎性小體表達的分析顯示：模型組大鼠腸黏膜內NLRP3、caspase-1的表達水平均明顯高于對照組，梔子苷組大鼠腸黏膜內NLRP3、caspase-1的表達水平均明顯低于模型組，提示腸黏膜內NLRP3炎性小體的表達在UC發病過程中明顯增多，梔子苷能夠降低腸黏膜內NLRP3炎性小體，發揮抑炎作用，提示梔子苷能夠通過抑制NLRP3炎性小體的表達來發揮對UC模型大鼠的治療作用。使用NLRP3炎性小體的抑制劑VX765干預后，VX765組大鼠的組織病理學評分，腸黏膜內TNF-α的含量及其mRNA表達量，IL-1、IL-18的含量，血清中DAO、D-乳酸的含量均明顯低于模型組，體重，攝食量，腸黏膜內ZO-1、Occludin、Claudin-1的蛋白質表達量均明顯高于模型組，而IL-1、IL-18的mRNA表達量與模型組的差異無統計學意義。這一結果表明，NLRP3炎性小體抑制劑夠減輕UC模型大鼠腸黏膜損傷，降低血清IL-1、IL-18水平，但不影響IL-1β、IL-18的mRNA轉錄水平，說明該抑制劑有效抑制了IL-1β和IL-18前體裂解為IL-1β、IL-18的過程。證明了NLRP3炎性小體的生物學功能為調控IL-1、IL-18前體的裂解而非調控IL-1β、IL-18的基因編碼。

綜上所述，UC大鼠腸黏膜內NF-κB通路和NLRP3炎性小體的過度激活介導了炎性反應的激活，梔子苷能夠通過抑制NF-κB通路和NLRP3炎性小體所介導的炎性反應來發揮治療UC的價值。盡管本實驗已經明確了梔子苷用于UC治療的價值及其相關分子機制，但進一步需要解決的問題是梔子苷與傳統UC治療藥物柳氮磺胺吡啶是否存在協同作用。為此，本課題組計劃在下一步實驗中設計梔子苷聯合柳氮磺胺吡啶的干預組，分析聯合給藥與單獨給藥治療UC效果的差異，旨在為臨床推廣梔子苷治療提供更為確切的依據。