CSF-1R在鼻咽癌細胞株中的表達情況及對細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響

曾 兵 郭海霞 徐清榜 張曉旻 郭莉莉 萬 野

集落刺激因子1 受體(CSF-1R)是免疫系統(tǒng)中最主要的調(diào)節(jié)因子之一，由原癌基因c-fms 編碼而產(chǎn)生。通過調(diào)節(jié)單核-吞噬譜系細胞的生成與生物活性來影響腫瘤的進一步發(fā)展。在體內(nèi)，CSF-1 通過結合CSF-1R 后自身磷酸化，并激活其磷酸化激酶域。與此同時，配體、受體結合形成二聚體形式。然后，效應蛋白的酪氨酸殘基磷酸化，引起巨噬細胞活化。被激活的單核巨噬細胞系統(tǒng)可以通過許多途徑促進腫瘤的發(fā)展，例如促進腫瘤生長、促進腫瘤新生血管生成、促進腫瘤細胞外基質(zhì)分解以及促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，CSF-1/CSF-1R 也直接影響腫瘤細胞的生長。目前，已有多種研究表明，CSF-1/CSF-1R 在各種惡性腫瘤中高表達[1～3]。但遺憾的是，目前仍沒有CSF-1 /CSF-1R 是否影響鼻咽癌進展的相關報道。本研究通過實時熒光定量PCR 及Western blot法從細胞實驗層面探討CSF-1R 在鼻咽癌細胞中的表達對細胞增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。筆者希望能為鼻咽癌的診斷及預后找到一個新的預測指標以及可能成為鼻咽癌患者的治療新靶點。

對象與方法

1.對象：(1)細胞：5-8F、6-10B 鼻咽癌細胞株及NP69 永生化正常鼻咽上皮細胞株購自APTT細胞庫，CNE-2 鼻咽癌細胞株由筆者醫(yī)院實驗中心惠贈。5-8F、6-10B、CNE-2 鼻咽癌細胞株使用RPMI1640 培養(yǎng)基混合10%胎牛血清于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。NP69鼻咽上皮細胞株使用加入0.05mg/ml BPE 和5ng/ml EGF 的 K-SFM 培養(yǎng)基于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。(2)主要試劑：CSF-1R 兔抗人單克隆抗體(ab61137)購自英國Abcam公司；鼠抗兔多克隆即用型二抗購自中杉金橋公司；免疫組化試劑盒購自中杉金橋公司；DAB 顯色試劑盒購自中杉金橋公司；南美洲胎牛血清購自美國Gibco公司；RPM1640 基礎培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；K-SFM 培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；細胞總RNA 抽提試劑盒購自天地揚生物科技公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天地揚生物科技公司；熒光定量PCR 試劑盒購自天地揚生物科技公司；RIPA 裂解液購自碧云天生物技術研究所；CSF-1R 兔抗人單克隆抗體購自美國CST 公司；鼠抗兔多克隆抗體購自中山金橋公司；ELC 發(fā)光系統(tǒng)購自碧云天生物技術研究所。

2.免疫組織化學實驗檢測治療前組織標本的CSF-1R 蛋白：將切片置于烤片架上放入60℃烤箱中烤片2h。將切片浸泡于二甲苯中脫蠟，15分鐘/次，共3次。然后按從高濃度到低濃度的順序，依次將切片浸泡于梯度乙醇(乙醇濃度依次為：100%、95%、90%、80%、70%)中，每個濃度中均浸泡5min。然后用雙蒸水洗片5分鐘/次，共3次。接著用 PBS 洗片5分鐘/次，共3次。具體步驟嚴格按照試劑盒說明進行。每一批次實驗中均設置陽性對照片和陰性對照片。已知陽性反應標本做為陽性對照，與實驗切片采用同種一抗、二抗。PBS 代替一抗作為陰性對照進行同步染色。

3.實時熒光定量PCR檢測：應用Primer5.0 引物設計軟件設計引物，并由Life Technologies 公司合成：CSF-1R:上游引物：5′-TCTGGTCCTATGGCATCCTC-3′，下游引物：5′-GATGCCAGGGTAGGGATTC-3′；Cyclin D1:上游引物，5′-GCGAGATGAGGCGATGGGGC-3′,下游引物：5′-CCTTCAGGGCGGCTGTGGTG-3′；Bcl-2:上游引物：5′-GTGACTTCCGATCAGGAAGG-3′，下游引物:5′-CTTCCAGACATTCGGAGACC-3′；BAX:上游引物：5′-AGTAACATGGAGCTGCAGAGG-3′，下游引物：5′-ATGGTTCTGATCAGTTCCGG-3′；MMP-2:上游引物：5′-ACTGTTGGTGGGAACTCAGAAG-3′，下游引物：5′-CAAGGTCAAT GTCAGGAGAGG-3′；GAPDH:上游引物：5′-AGCCACATCGCTCAGACAC-3′，下游引物：5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′。5-8F、6-10B、CNE-2、NP69 4株細胞分別培養(yǎng)之后使用胰蛋白酶處理制成細胞懸液，用細胞計數(shù)板計數(shù)細胞后，取含有約1×106個細胞的細胞懸液轉(zhuǎn)移至RNase-Free 的離心管中，離心收集細胞沉淀。其余步驟嚴格按照試劑盒說明進行。實時熒光定量PCR 實驗結果采用△△CT 計算方法，即樣品mRNA 值=2-△△CT。△CT=目的基因CT 值-內(nèi)參基因CT 值；△△CT=實驗組△CT-對照組△CT。實驗組即5-8F、6-10B、CNE-2 細胞株；對照組即NP69 細胞株。

4.Western blot法檢測：5-8F、6-10B、CNE-2、NP69 4株細胞分別培養(yǎng)約1×106個細胞后， 用PBS 洗2遍，然后用含有PMSF 的RIPA 裂解液300μl 處理細胞，吹打數(shù)下，使裂解液充分接觸細胞，待細胞充分裂解后，14000×g離心5min，取上清分裝于EP 管中保存于-70℃冰箱內(nèi)。Western blot法實驗條帶采用掃描儀圖像掃描后，用Quantity One 4.6.2 軟件進行條帶處理分析。目標蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。實驗組為5-8F、6-10B、CNE-2 細胞株；對照組為NP69 細胞株。

結 果

1.實時熒光定量PCR檢測CSF-1R的表達情況：如圖1、表1所示，發(fā)現(xiàn)5-8F細胞株中CSF-1RmRNA的表達明顯高于NP69細胞株(P=0.000)，6-10B細胞株中CSF-1RmRNA的表達明顯低于NP69細胞株(P=0.000)，CNE-2細胞株中CSF-1RmRNA的表達水平略高于NP69細胞株，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.057)。

圖1 實時熒光定量PCR檢測

表1 5-8F、6-10B、CNE-2及NP69細胞株中CSF-1RmRNA的相對表達水平

2.Western blot法檢測CSF-1R的表達情況：如表2所示，發(fā)現(xiàn)僅5-8F鼻咽癌細胞株中CSF-1R蛋白表達陽性，6-10B(P=0.370)、CNE-2(P=0.480)鼻咽癌細胞株及NP69正常鼻咽上皮細胞株中CSF-1R蛋白表達均為陰性(圖2)。5-8F細胞株相對于NP69細胞株明顯呈現(xiàn)CSF-1R蛋白高表達(P=0.007)。

表2 CSF-1R在5-8F、6-10B、CNE-2及NP69細胞株中的相對表達量比較

圖2 Western blot法檢測結果

3.CSF-1R與細胞增殖因子CyclinD1、凋亡因子Bcl-2及BAX、侵襲轉(zhuǎn)移因子MMP-2的相關性：如表3所示，發(fā)現(xiàn)5-8F細胞株中CyclinD1mRNA的表達水平均顯著高于6-10B細胞株(P=0.000)。5-8F細胞株中表達的Bcl-2mRNA顯著高于6-10B細胞株(P=0.000)，BAXmRNA顯著低于6-10B細胞株(P=0.000)，Bcl-2mRNA/BAXmRNA比值顯著高于6-10B細胞株(P=0.000)。5-8F細胞株中MMP-2mRNA的表達水平顯著高于6-10B細胞株(P=0.000)。

表3 5-8F與6-10B細胞株中CyclinD1、Bcl-2、BAX、MMP-2mRNA的表達水平對比 (n=10)

討 論

CSF-1是由巨噬細胞、成纖維細胞和腫瘤細胞等非造血細胞合成分泌的一個負責激活巨噬細胞，并促進其增殖、分化的重要的生長因子。它通過結合其受體CSF-1R，促進細胞外結合域構象的改變，使得其相鄰受體細胞間的交互作用更穩(wěn)定，從而形成二聚體。同時促進二聚體細胞質(zhì)酪氨酸殘基磷酸化，進一步調(diào)節(jié)其效應細胞的生長、成熟，激活相應的靶細胞，多方面協(xié)同效應促進腫瘤進一步發(fā)展[4]。研究發(fā)現(xiàn)CSF-1R在頭頸部腫瘤中表達異常增高，并且在結直腸癌中也發(fā)現(xiàn)CSF-1R表達高于正常組織[5]。然而，到目前為止，據(jù)筆者查閱文獻，本研究首次提出了CSF-1R在鼻咽癌組織中呈現(xiàn)高表達水平。并且筆者從多個角度證明了這種高水平的表達與鼻咽癌的預后有一定的關聯(lián)性。CSF-1R主要表達在鼻咽癌腫瘤組織細胞的核膜上，其次在細胞質(zhì)中也有少量表達。免疫組織化學結果顯示，CSF-1R在鼻咽癌中明顯高表達(P=0.000)。但Sabitha Aligeti等研究顯示當內(nèi)源性的CSF-1/CSF-1R過度表達時，卵巢癌細胞的侵襲能力、附著力，以及能動性增加，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的概率大大增加[6]。

通過實時熒光定量PCR和Western blot法實驗發(fā)現(xiàn)5-8F細胞株中CSF-1R在基因水平和蛋白水平均顯著高表達(P=0.000、P=0.007)，而6-10B細胞株中CSF-1R在基因水平明顯低表達(P=0.000)，但蛋白水平與NP69正常鼻咽上皮細胞株一樣均顯示為陰性表達(P=0.370)。說明6-10B不論是在基因水平，還是在蛋白水平均表現(xiàn)為CSF-1R低表達狀態(tài)。此外，CNE-2細胞株中CSF-1R在基因和蛋白水平的表達呈現(xiàn)與NP69差別不大(P=0.057、P=0.481)。因此，筆者選取CSF-1R高表達細胞株5-8F和CSF-1R低表達細胞株6-10B進行進一步研究。CyclinD1是調(diào)控細胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化的周期素。當CyclinD1基因擴增時，細胞增殖周期將失調(diào)，從而促進腫瘤的發(fā)生。

本研究發(fā)現(xiàn)，CSF-1R高表達細胞株5-8F中CyclinD1的表達水平明顯高于CSF-1R低表達細胞株6-10B(P=0.000)，說明5-8F鼻咽癌細胞增殖能力明顯強于6-10B。Bcl-2抗凋亡蛋白和Bax促凋亡蛋白在鼻咽癌細胞凋亡調(diào)控過程中起到了重要作用。鼻咽癌細胞中，Bcl-2存在于細胞線粒體上，通過改變線粒體膜的通透性阻止細胞色素C的釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則通過與線粒體膜上Bcl-2結合形成同源二聚體，參與構成跨線粒體膜的孔道蛋白，從而降低跨膜電位引導細胞色素C的外流引起細胞凋亡。Bcl-2與Bax表達的平衡直接決定細胞是否凋亡，因此，Bcl-2與Bax的比率(Bcl-2/Bax)是臨床腫瘤預后的標志物之一[7]。

本研究發(fā)現(xiàn)相對于細胞株6-10B細胞株，5-8F中凋亡因子Bcl-2明顯高表達、Bax明顯低表達(P=0.000、P=0.000)。5-8F細胞株中Bcl-2/Bax高于6-10B細胞株(P=0.000)。換句話說CSF-1R高表達細胞株5-8F的凋亡水平低于CSF-1R低表達細胞株6-10B。腫瘤從原發(fā)灶向周圍組織侵襲轉(zhuǎn)移的過程中，必須先降解細胞外基質(zhì)和基膜，而基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族在這一過程中起到了重要作用。MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶基因家族中降解Ⅳ型膠原最主要的酶之一。在多種腫瘤如頭頸組織、肺、乳腺、前列腺、直腸等的進展過程中發(fā)揮著重要作用[8～11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，5-8F細胞株中MMP-2侵襲轉(zhuǎn)移因子表達水平明顯高于CSF-1R低表達細胞株6-10B細胞株(P=0.000)，說明5-8F細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力強于6-10B細胞。通過將CSF-1R高表達細胞株5-8F和CSF-1R低表達細胞株6-10B中CyclinD1、Bcl-2/Bax、MMP-2的表達水平進行比較，發(fā)現(xiàn)CSF-1R高表達細胞株5-8F的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力更強，而細胞凋亡能力則較弱。由此，筆者預測CSF-1R高表達的鼻咽癌患者更容易發(fā)生腫瘤進展，預后更差。這一結果正好與鼻咽癌組織免疫組化的結果相吻合。雖然CSF-1R高表達誘導鼻咽癌進展的具體機制尚不清楚，還有待于進一步研究。但就目前了解的資料來看，這可能與CSF-1/CSF-1R依賴性的巨噬細胞異常活躍有關[12]。其他腫瘤研究的證據(jù)也支持筆者此觀點。Allavena等[13]在骨肉瘤小鼠模型中的研究表明，CSF-1/CSF-1R過表達可以促進腫瘤相關巨噬細胞的分化和功能的激活，從而促進腫瘤快速進展且預后較差[14，15]。因此，筆者預測在不遠的將來CSF-1R或許成為鼻咽癌診療的一個潛在靶點。

綜上所述，鼻咽癌細胞與正常鼻上皮細胞株之間CSF-1R的表達差異有統(tǒng)計學意義。CSF-1R的表達與細胞增殖因子CyclinD1、凋亡因子Bcl-2及BAX、侵襲轉(zhuǎn)移因子MMP-2的表達有一定的相關性，CSF-1R表達水平越高，細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移能力越強，凋亡能力越弱。