轉化生長因子β1誘導胰腺癌腫瘤干細胞產生的研究

史壹雄 梁雅琴 葉百亮 胡炳仁 阮小蛟

胰腺癌細胞具有極強的運動侵襲能力，早期即可出現胰周組織侵襲浸潤或遠處轉移，導致根治性手術切除率極低和術后短期內腫瘤復發轉移，造成患者死亡[1,2]。腫瘤干細胞(cancer stem cell，CSC)是腫瘤組織中具有永久自我更新能力并能產生異質性腫瘤細胞的細胞，所占比例極少，但因具有永久自我更新能力，故是腫瘤源源不斷產生的根源[3,4]。白細胞分化抗原(cluster of differentiation，CD)133是最常用的干細胞的表面標志物，CD133陽性細胞具有自我更新和無限增殖、致瘤性強等特點，而CD133陰性的細胞缺乏這種潛力[5]。最近研究發現，CD133與腫瘤惡性程度和侵襲性相關，并且其表達程度與胰腺癌患者的存活率降低相關[6]。通過上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型，能為腫瘤細胞提供運動遷徙和向鄰近組織侵襲的能力[7,8]，EMT典型表現為鈣黏蛋白E(E-cadherin)丟失。研究表明胰腺癌患者體內TGF-β1呈現過度表達狀態，高血清轉化生長因子β1(TGF-β1)水平與胰腺癌的不良預后相關[9]。TGF-β1是EMT的重要誘導因子，EMT在增強腫瘤細胞運動侵襲能力的同時，還能誘導腫瘤細胞獲得CSC特性[10,11]。 本研究通過將TGF-β作用于PANC-1、BxPC-3、AsPC-1 3種胰腺癌細胞系，研究TGF-β對胰腺癌細胞生長的影響及CD133表達的影響，并檢測胰腺癌細胞EMT相關因子，E-cadherin和波形蛋白(vimentin)的表達，探討TGF-β在胰腺癌的發展過程中的所起作用，為從干細胞的層面上抑制胰腺癌的侵襲、轉移提供新的思路。

材料與方法

1.細胞系和細胞培養:本研究采用3種人類胰腺癌細胞系：PANC-1、BxPC-3和AsPC-1細胞株作為體外模型，購于中國科學院上海細胞生物學研究所。PANC-1細胞和BxPC-3細胞培養于添加了10%胎牛血清的DMEM培養基(Dulbecco′s Modified Eagle Media培養基, 500ml C11995, 美國Gibco公司)中進行，AsPC-1細胞培養于添加了10%胎牛血清的 R PMI-1640培養基(RPMI MEDIUM 1640,500ml,C11875, 美國Gibco公司)中進行。以上3種細胞均培養于CO2含量5%，37℃及飽和濕度的恒溫培養箱中。TGF-β1(美國R&D systems公司)儲存于添加了0.1%的胎牛血清的4mmol/L晶體鹽酸溶液中凍存于-20℃冰箱，在每次實驗前融化并溶解在各細胞相應的含10%胎牛血清的培養基中。

2.細胞計數法：取3種人類胰腺癌細胞系對數生長期細胞，制成單細胞懸液，對照組培養基為含10%胎牛血清的普通培養基，實驗組培養基為含10ng/ml TGF-β1的10%胎牛血清培養基，各2ml，第1～6孔細胞分別培養1、2、3、5、6天，每3天更換培養液，第1天取第1孔細胞分別取實驗組及對照組用細胞計數器行癌細胞計數，第2天取第2孔細胞行癌細胞計數，依次類推。上述實驗重復3次。使用Excel繪制生長曲線，并作圖法在細胞生長曲線的對數生長期找出細胞增加一倍所需的時間即細胞倍增時間，即在Excel內添加生長曲線的趨近線，并同時顯示公式y=k×ex，k為一常數系數，在細胞指數生長期內分別取兩個呈倍增關系的y值，根據公式y=k×ex計算相應x值，兩x值相減即為細胞倍增時間。

3.流式細胞學:每種胰腺癌細胞系處理時分3組，即空白組、對照組、實驗組，每種胰腺癌細胞以5×105個/ml的濃度種植于6孔板內，每孔包含10%胎牛血清的培養基2ml，實驗組孵育過夜后換用TGF-β1濃度為10ng/ml的10%胎牛血清的相應培養基2ml，空白組與對照組則加不包含TGF-β1的普通10%胎牛血清的培養基2ml。作用72h后獲得對數生長期的胰腺癌細胞，胰酶(0.25%Trypsin-EDTA, 1X, 100ml, 美國Gibco公司)消化獲得單細胞懸液，對照組與實驗組均在避光條件下在細胞液內加樣反應。避光條件下在細胞培養液內加樣反應：依次加入80μl PBSE(pH值為7.2的PBS，含0.5%BSA,2mmol/L的EDTA液即10ml PBS液中加入0.05g BSA 和 7.45mg EDTA)，再加入20μl FCR blocker試劑(德國Miltenyi Biotec公司)及10μl CD133/1 (AC133)-PE, human(德國Miltenyi Biotec公司,貨號：130-080-801)，室溫避光孵育20min后再次用PBSE漂洗2次，振蕩混勻后于1h內使用Beckman Coulter FC500 流式細胞儀，使用CXP流式細胞學軟件 (美國Beckman Coulter公司) 上機檢測CD133+的表達率, 空白組不經過上述加樣過程直接使用 CXP 流式細胞學軟件上機檢測CD133+的表達率。

4.PANC-1及TGF-β1表達Western blot法檢測：蛋白樣品制備：組織勻漿，裂解，臺式離心機，11000r/min，4℃離心10min。BCA法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，封閉，孵育一抗，洗膜，孵育二抗，洗膜，化學發光顯影。actin作為參照基因。 E-cadherin (cell signaling，#3195)，一抗濃度1∶1000，二抗濃度(anti rabbit)1∶3000，135000；Vimentin (美國R&D system公司，AF2105 )，一抗濃度1∶1000，二抗濃度(anti goat)1∶3000，55000。

結 果

1.TGF-β1對3種胰腺癌細胞生長的影響:TGF-β1處理PANC-1實驗組細胞及無處理對照組6天培養結果顯示兩組細胞均呈對數生長，培養前3天，兩組生長速度相似，兩組細胞計數無顯著性差異(P>0.05)，培養第5天及第6天，與對照組比較，實驗組胰腺癌細胞生長明顯受抑制，其細胞計數顯著低于對照組(P均<0.05)，PANC-1對照組、實驗組培養5天的PANC-1胰腺癌細胞數分別為(13.70±1.03)×105個、(9.97±0.95)×105個；兩組培養6天的PANC-1胰腺癌細胞數分別為(24.10±2.64)×105個、(15.41±1.35)×105個，詳見圖1。計算對照組和實驗組細胞群體倍增時間分別為29.0和35.2h，倍增時間明顯延長。

圖1 TGF-β1對PANC-1細胞生長的影響

TGF-β1處理BxPC-3實驗組細胞及無處理對照組6天培養結果顯示兩組細胞亦呈指數生長，培養前2天，兩組生長速度相似，兩組細胞計數比較，差異無統計學意義(P>0.05)，培養第3天及第5天，與對照組比較，實驗組胰腺癌細胞生長明顯受抑制，其細胞計數顯著低于對照組(P均<0.05)，第6天實驗組細胞計數較對照組有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。BxPC-3對照組、實驗組培養3天的BxPC-3胰腺癌細胞數分別為(5.24±0.31)×105個、(4.85±0.33)×105個；兩組培養5天的BxPC-3胰腺癌細胞數分別為(12.97±0.64)×105個、(8.78±0.36)×105個；兩組培養6天的BxPC-3胰腺癌細胞數分別為(20.71±2.51)×105個、(14.36±3.55)×105個，詳見圖2。計算對照組和實驗組細胞群體倍增時間分別為34.8和41.2h，倍增時間明顯延長。

圖2 TGF-β1對BxPC-3細胞生長的影響

TGF-β1處理AsPC-1實驗組細胞及無處理對照組6天培養結果顯示兩組細胞均呈對數生長，培養前2天，兩組生長速度相似，兩組細胞計數比較差異無統計學意義(P>0.05)，培養第3天、第5天及第6天，與對照組比較，實驗組胰腺癌細胞生長明顯受抑制，其細胞計數顯著低于對照組(P均<0.05)，AsPC-1對照組和實驗組培養3天的AsPC-1胰腺癌細胞數分別為(4.75±0.35)×105個、(3.83±0.06)×105個；兩組培養5天的AsPC-1胰腺癌細胞數分別為(12.67±0.81)×105個、(10.93±1.37)×105個；兩組培養6天的AsPC-1胰腺癌細胞數分別為(18.72±1.21)×105個、(14.53±2.34)×105個，詳見圖3。對照組和實驗組細胞群體倍增時間分別為30.8和34.49h,倍增時間延長。

圖3 TGF-β1對AsPC-3細胞生長的影響

2.3種胰腺癌細胞系CD133+胰腺癌細胞比例：TGF-β1作用于人類胰腺癌PANC-1、BxPC-3及AsPC-1細胞系72h后，流式細胞術檢測胰腺癌細胞系中CD133+細胞比例變化情況，結果顯示PANC-1胰腺癌細胞系空白組、對照組、實驗組CD133+細胞率分別為(23.57±5.46)×104、(28.78±14.38)×104及(105.90±27.82)×104，BxPC-3胰腺癌細胞系空白組、對照組、實驗組CD133+細胞率分別為(47.73±5.86)×104、(51.60±7.75)×104及(124.73±52.84)×104，AsPC-1胰腺癌細胞系空白組、對照組、實驗組CD133+細胞率分別為(39.20±4.81)×104、(39.96±5.13)×104及(88.80±15.94)×104，詳見圖4、圖5。

圖4 3種胰腺癌細胞空白組、對照組及實驗組流式細胞學檢測CD133+細胞率

獨立樣本t檢驗顯示，PANC-1、BxPC-3及AsPC-1 3種胰腺癌細胞系空白組與對照組CD133+細胞比例比較，差異無統計學意義，3種胰腺癌細胞細胞系實驗組與對照組比較，CD133+細胞比例實驗組較對照組明顯升高(P<0.05，圖5)。

圖5 3種胰腺癌細胞不同處理組CD133+細胞比例(1/萬)

3.Western blot法檢測結果：(1)PANC-1胰腺癌細胞系E-cadherin表達：Western blot法檢測結果顯示，10ng/ml TGF-β1處理組PANC-1胰腺癌細胞E-cadherin表達較正常組有降低趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05，圖6)。(2)PANC-1胰腺癌細胞系Vimentin表達：Western blot法檢測結果顯示， 10ng/ml TGF-β1處理組PANC-1胰腺癌細胞Vimentin表達較對照組有有升高趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05,圖7)。

圖6 E-cadherin Western blot法檢測結果

圖7 Vimentin Western blot法檢測結果

討 論

在腫瘤形成過程中，TGF-β1可能以自分泌或旁分泌的方式而對腫瘤的進展起雙相調節作用。早期腫瘤形成過程中，TGF-β1起抑制細胞周期進程的作用，進而抑制腫瘤生長。 相反，癌細胞后來通過增加TGF-β1拮抗劑的表達、突變TGF-β1受體或使SMAD4失活逐漸對 TGF-β1-介導的生長抑制作用產生了適應和抵抗，最終，TGF-β1對腫瘤的生長抑制作用消失，并進而轉變為通過提升EMT或誘導血管生成而促進腫瘤細胞的轉移[12,13]。

本研究發現，胰腺癌細胞在TGF-β1作用后生長速度減緩，倍增時間延長，TGF-β1在生長的中后期均能顯著抑制3種腫瘤細胞的生長速率，但起效及作用持續時間不同。

TGF-β1作用后能顯著提高胰腺癌BxPC-3及AsPC-1細胞系中CD133+細胞比例(P<0.05)。而CD133+陽性細胞代表胰腺癌CSC,CD133+胰腺CSC已被證明是具有完全的致瘤性，以及對放化療高度抵抗，且CD133陽性的胰腺癌CSC對腫瘤的轉移至關重要[14～16]。

流式細胞學實驗結果提示10ng/ml的TGF-β1作用后3種胰腺癌細胞系的CD133+表達增加了。這里似乎有矛盾之處，TGF-β1抑制了胰腺癌細胞的生長，但卻提高了CSC的比例，可能有兩種原因造成以上結果：(1)TGF-β1抑制了非致腫瘤細胞的生長，但對CSC的作用甚微，故導致CSC相對增多，其比例增高。(2)10ng/ml的TGF-β1雖抑制了普通非致腫瘤細胞的生長，但誘導CSC干細胞形成，TGF-β1作為腫瘤EMT的誘導劑，腫瘤細胞的EMT和CSC之間存在著“相輔相成”的有機聯系，腫瘤細胞可通過EMT而獲得CSC的特性，從而獲得高致瘤能力。You等[17]研究采用EMT的誘導因子TGF-β作用于CD133-的肝癌細胞，發現能誘導產生CD133+的肝癌細胞，且體內荷瘤實驗證明誘導產生的CD133+肝癌細胞與野生型CD133+肝癌細胞的致瘤能力未見明顯差異，具有肝癌CSC特性。

腫瘤細胞的運動侵襲能力和CSC特性對于實現腫瘤進展同等重要，兩者缺一不可。上皮屏障功能和完整性依賴于細胞間連接的形成。鈣黏蛋白(E-cadherin)構成的主要跨膜組件和黏合連接處并且對上皮和信息交互至關重要。鈣黏蛋白丟失常被病理學家使用作為腫瘤細胞入侵的一個標志。用轉基因動物實驗證明鈣黏蛋白的過表達可預防腫瘤的轉移和侵襲。本研究發現PANC-1胰腺癌細胞系E-cadherin有降低趨勢，且Vimentin有增高趨勢，但均無顯著性差異，考慮細胞培養時間尚短，相當于胰腺癌細胞發展早期，故TGF-β1誘導EMT作用不顯著有關。研究顯示，采用不同劑量(5、10、20、50ng/ml)的TGF-β1作用BxPC-3胰腺癌細胞均24h，各劑量E-cadherin的表達比較，差異無統計學意義；而采用不同時間(0、4、7、14天)的TGF-β1，劑量均為10ng/ml 作用BxPC-3胰腺癌細胞，結果顯示E-cadherin的表達隨著作用時間的延長而降低，從4～7天開始有差異[18]。研究證實，Erk途徑的激活參與TGF-β1誘導的EMT過程[19]。TGF-β1雖然對BxPC-3、 AsPC-1及PANC-1 3種胰腺癌細胞系均有抑制其細胞生長作用，但TGF-β1作用增加CSC比例，故提示非選擇性應用TGF-β1可能并不利于胰腺癌細胞的生長，卻能提高CD133+的比例，增加胰腺癌細胞的侵襲性及致瘤性，TGF-β1在不同時期對胰腺癌細胞的作用及其具體機制將成為未來的研究重點。