白介素4對脂多糖刺激后小膠質(zhì)細胞表型改變及其機制

蔣 倩 趙 愷 堯小龍 丁 衛(wèi) 岳鵬杰 胡 峰 劉勝文 張華楸

創(chuàng)傷性顱腦損傷(TBI)后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system, CNS)中的炎性反應(yīng)對神經(jīng)損傷和修復(fù)具有重要意義。而其固有的免疫細胞—小膠質(zhì)細胞(microglia)在整個病理生理過程中發(fā)揮了重要作用[1]。大量研究表明小膠質(zhì)細胞在外傷后可以快速的活化，由靜息態(tài)M0表型轉(zhuǎn)化為炎癥型M1，后者通過釋放大量炎性因子和氧化介質(zhì)，加重神經(jīng)血管損傷。與此同時在抑炎因子的誘導(dǎo)下，部分小膠質(zhì)細胞又M0向M2 型轉(zhuǎn)化，通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進神經(jīng)元的修復(fù)和再生[2]。如何在外傷后促進小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，減輕CNS損傷和促進神經(jīng)功能的修復(fù)和重建，是當前神經(jīng)科學(xué)研究的熱點[3]。

已有研究證實，小膠質(zhì)細胞的表面的TLR4的激活參與了M1型的激活。脂多糖(LPS)作為TLR4的配體，能快速的激活其下游信號通路，促進細胞由M0 向M1型的轉(zhuǎn)化和炎性因子的釋放[4]。筆者前期的研究也表明通過抑制TLR4 的活化能降低M1型小膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)化。 也有研究報道抑炎因子如IL-4、IL-10 等也可以參與小膠質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)化，促進M2 型的產(chǎn)生[5]。但是這一作用的信號機制如何，是否參與TLR4信號通路的調(diào)控尚不清楚。針對以上問題，筆者通過LPS刺激離體培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)其向M1表型轉(zhuǎn)化，同時采用IL-4及其下游信號分子干預(yù)后，檢測TLR4下游信號通路活化情況和小膠質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)換情況。從而明確IL-4對M1型活化的小膠質(zhì)細胞的作用和信號分子機制。為今后調(diào)控外傷后小膠質(zhì)細胞的表型轉(zhuǎn)換，抑制其炎癥損傷，促進神經(jīng)修復(fù)和重塑提供新的途徑。

材料與方法

1.材料:實驗動物C57BL/10ScNJ小鼠由同濟醫(yī)院動物中心提供[實驗動物許可證號：SYXK(鄂)2014-0049]，多克隆抗體TLR4購自美國Santa Cruz公司，MyD88，磷酸化NF-κB、總NF-κB、iNOS、Arg1、磷酸化STST3、總STAT3、磷酸化STST6、總STST6購自英國Abcam公司，STAT6抑制劑Leflunomide購自美國Sigma公司，DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo公司，PCR mix購自日本Toyobo公司，PCR引物由上海生工生物公司合成，序列如下： iNOS上游引物：5′-GTTTGACCAGAGGACCCAGA-3′，下游引物：5′-GTGAGCTGGTAGGTTCCTGT-3′；Arg1上游引物：5′-CAGTTGGCCTTTGGATACCG-3′，下游引物：5′-CCAGAGATGCTTCCAACTGC-3′；GAPDH上游引物：5′-AACGACCCCTTCATTGACCT-3′，下游引物:5′-ATGTTAGTGGGGTCTCGCTC-3′。

2.小膠質(zhì)細胞的分離和培養(yǎng)：取C57BL/10ScNJ新生小鼠(1～2天)，在無菌操作臺小心分離并取出大腦皮質(zhì)，加0.125%胰蛋白酶，用巴氏吸管反復(fù)吹打使腦組織分散，加等量含10%FBS的完全培養(yǎng)基，離心，棄上清，用含有20%FBS的完全培養(yǎng)基重懸，按照1×106個細胞/毫升細胞懸液的密度種植細胞，到每個T75培養(yǎng)瓶中接種10ml懸液，置于37℃+5%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，36h后使用20%完全培養(yǎng)基(含有20%FBS，1%青鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基)換液后繼續(xù)培養(yǎng)，10～12天取培養(yǎng)瓶在37℃搖床上以200r/min搖晃30min，取上清液，離心后按原培養(yǎng)基∶新鮮培養(yǎng)基=1∶1的比例重懸細胞，接種到培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)2天后待用。

3.細胞免疫熒光:在24孔板上按1×105個細胞/孔的密度種板，待細胞處理完成后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS洗5min×3次，0.3%Triton-PBS破膜5min，PBS搖洗5min×3次，加入2%BSA-10%山羊血清-PBS，37℃封閉45min，加1%BSA-PBS稀釋一抗，4℃冰箱過夜，次日 PBS洗 5min×3次，加1%BSA-PBS稀釋二抗，常溫孵育45min，PBS洗 5min×3次，使用PBS按1∶4稀釋DAPI染色5min，PBS洗5min×3次，在正置熒光顯微鏡下觀察拍照。

4.Western blot法檢測：在6孔板中按照1×106個細胞/孔的密度種板，按不同因素處理細胞，提取蛋白，使用12%分離膠電泳，轉(zhuǎn)膜1.5h，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，TBST漂洗10min×3次，用5%TBST稀釋的BSA稀釋一抗，分別與膜接觸4℃孵育過夜后，用TBST漂洗10min×3次，加二抗室溫下孵育1h后，用TBST洗膜10min×3次，在Gene Gnome曝光儀上曝光并拍照。

5.實時定量PCR檢測:在6孔板中按照1×106個細胞/孔的密度種板，按不同因素處理細胞，每孔加入1ml Trizol裂解液裂解細胞，提取RNA，測定RNA的含量(A260值)和純度(A260/A280)，按照Thermo First Stand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace-α-試劑盒的說明做反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，采用20μl體系，30個循環(huán)。然后采用Toyobo pcr mix試劑盒做聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，采用20μl反應(yīng)體系，每個反應(yīng)管中分別加入1μl模板(cDNA)、1μl前引物、1μl后引物,10μl PCR mix,7μl DEPC水，在Thermo多功能PCR儀上進行實時定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)采用35個循環(huán)。

結(jié) 果

1.原代小膠質(zhì)細胞的形態(tài)學(xué)改變:原代培養(yǎng)的M0型(靜息態(tài))小膠質(zhì)細胞為多個長突觸不規(guī)則型(圖1中A、E)；LPS刺激后，其突觸縮短，胞體增大，形成阿米巴樣M1型(激活態(tài))(圖1中B、F)；IL-4作用后，小膠質(zhì)細胞的形態(tài)與對照組比較未發(fā)生明顯改變(圖1中C、G)；將 LPS刺激的小膠質(zhì)細胞再加入IL-4后，其典型的阿米巴樣細胞減少。(圖1中D、H)。

圖1 小膠質(zhì)細胞在不同刺激下的形態(tài)改變

2.LPS和IL-4對原代小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)換的作用：在LPS的作用下，小膠質(zhì)細胞活化，其M1表型標志物iNOS與對照組比明顯增高(圖2中B、C)；而在IL-4的作用下，M2型標志物Arg1表達明顯上調(diào)(圖2中A、C、F、J)；在LPS與IL-4的共同作用下，小膠質(zhì)細胞iNOS和Arg1表達與對照組比較均增高，而與LPS組比較，iNOS表達下降，Arg1升高，與IL-4組比較，iNOS表達上調(diào)，Arg1表達下調(diào)(圖2)。

圖2 LPS和IL-4對原代小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)換的作用(細胞免疫熒光，×400)

3.LPS和IL-4對小膠質(zhì)細胞TLR4信號通路活化的影響:與對照組相比，LPS作用于小膠質(zhì)細胞后，TLR4、MyD88、磷酸化NF-κB蛋白表達明顯升高，而在IL-4的單獨作用下，TLR4下游的MyD88以及磷酸化NF-κB蛋白表達無明顯改變。當LPS與IL-4共同作用時，與對照組比較，TLR4表達上調(diào)，MyD88、NF-κB蛋白表達也有增高；但與LPS組比較，TLR4表達未下調(diào)，但MyD88、NF-κB蛋白表達明顯下調(diào)(圖3)。

圖3 小膠質(zhì)細胞TLR4/MyD88/NF-κB蛋白表達改變

4.IL-4下游信號通路對TLR4下游信號系統(tǒng)的影響機制:與對照組比較， LPS對小膠質(zhì)細胞STAT3和STAT6的磷酸化無明顯影響；IL-4則可以促進STAT6的磷酸化增高。當IL-4與LPS共同作用時，IL-4誘導(dǎo)的STAT6的磷酸化功能仍然存在(圖4A)。將STAT6特異性抑制劑Leflunomide分別加入IL-4和IL-4+LPS組，檢測TLR4下游信號通路的活化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)加入抑制劑Lef后，與對照組比較NF-κB的活性顯著提高，同時STAT6的磷酸化明顯下調(diào)(圖4中B、C)，與IL-4組比較，IL-4+Lef組的小膠質(zhì)細胞磷酸化STAT6以及M2型標記Arg1表達均明顯下調(diào)(圖4C)。

圖4 IL-4下游信號通路對TLR4下游信號系統(tǒng)的影響機制

討 論

大量研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫-炎性反應(yīng)是創(chuàng)傷性顱腦損傷神經(jīng)元壞死、凋亡和神經(jīng)功能損傷的主要機制之一。做為CNS固有的免疫細胞，小膠質(zhì)細胞在反應(yīng)中起了重要作用。近年來不少研究報道TBI后TLR4信號通路的激活，是導(dǎo)致炎性反應(yīng)和神經(jīng)功能損傷的重要因素。通過抑制TLR4及其下游信號通路，可以有效減少損傷區(qū)域的炎性反應(yīng)并促進神經(jīng)功能和血管結(jié)構(gòu)的修復(fù)[6]。IL-4是一類經(jīng)典抑炎因子，在炎癥調(diào)控和細胞增殖方面均有顯著作用。研究發(fā)現(xiàn)，在CNS損傷后早期，就伴隨著IL-4表達的明顯增多[7]。同時有研究者發(fā)現(xiàn)，IL-4有顯著的抑制細胞凋亡、促進神經(jīng)元再生以及膠質(zhì)細胞分化作用，主要表現(xiàn)為通過誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞的分型轉(zhuǎn)化抑制后者促炎性因子的產(chǎn)生來減少對神經(jīng)元的損傷[8，9]。

因此，筆者采用原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細胞為研究對象，通過TLR4的特異性激動劑LPS以及抑炎性因子IL-4產(chǎn)生干預(yù)作用，探索IL-4對TLR4信號通路的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小膠質(zhì)細胞中，LPS能誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞從靜息狀態(tài)的長分支狀轉(zhuǎn)變?yōu)榘⒚装蜆樱せ钇銽LR4/MyD88/NF-κB信號通路，上調(diào)下游的促炎性介質(zhì)iNOS表達(圖1～圖3)。而在IL-4的作用可以抑制由LPS激活的小膠質(zhì)細胞磷酸化NF-κB的表達上調(diào)，進而抑制促炎性因子的表達，說明IL-4可以抑制小膠質(zhì)細胞的炎性反應(yīng)(圖3)。

從上面的研究結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞在炎性反應(yīng)中功能的可調(diào)節(jié)性。有研究者發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷模型中，損傷早期M2型小膠質(zhì)細胞數(shù)量增多，而隨著時間的推移，M2型的小膠質(zhì)細胞在促炎性因子的作用下，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型細胞[2]。而多項研究指出，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞由M1型(促炎型)向M2型(抑炎型)轉(zhuǎn)化能夠促進神經(jīng)功能的損傷修復(fù)[10]。實際上，IL-4作為重要的炎性調(diào)節(jié)因子，也可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)化[11]。本實驗中筆者選擇iNOS作為M1型的標記，而Arg1作為小膠質(zhì)細胞M2型的標記，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-4可以誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞Arg1表達升高，而iNOS表達下降，說明IL-4可以誘導(dǎo)靜息狀態(tài)下以及活化為M1型的小膠質(zhì)細胞向M2型轉(zhuǎn)化(圖2)。

研究表明，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子6(STAT6)在小膠質(zhì)細胞向M2表型轉(zhuǎn)化的過程中起重要調(diào)控作用[12]。近年來，Bhattarai等[13]發(fā)現(xiàn)IL-4可以通過STAT6調(diào)節(jié)CNS內(nèi)的免疫細胞進而促進神經(jīng)元再生。而同樣作為轉(zhuǎn)錄因子的STAT3被發(fā)現(xiàn)在CNS中抑制細胞凋亡、促進血管再生、調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞對損傷的反應(yīng)性上也有重要作用[14～17]。在本研究中，為了進一步探究IL-4對TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的作用機制，筆者檢測了IL-4下游信號蛋白STAT6和STAT3在小膠質(zhì)細胞的表達改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細胞在LPS作用后，STAT3和STAT6蛋白磷酸化表達均無明顯改變。在IL-4作用下，STAT3磷酸化表達無明顯改變，STAT6的磷酸化表達明顯增高，在LPS與IL-4的共同作用下，STAT6的磷酸化較對照組上調(diào)，但較LPS組下調(diào)(圖4)，而且這種變化趨勢與小膠質(zhì)細胞的NF-κB的磷酸化以及M1型標記iNOS變化趨勢相反，與M2型標記的變化趨勢相同。為進一步探究STAT6在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)中的作用，筆者應(yīng)用STAT6的特異性抑制劑Leflunomide加以干預(yù)，發(fā)現(xiàn)Leflunomide可以抑制IL-4介導(dǎo)的磷酸化STAT6以及Arg1的表達下調(diào)，同時使IL-4+LPS組的磷酸化NF-κB表達上調(diào)，由此證明小膠質(zhì)細胞可以通過下游的轉(zhuǎn)錄因子STAT6抑制TLR4下游信號分子NF-κB的磷酸化以及介導(dǎo)小膠質(zhì)細胞由M1向M2表型轉(zhuǎn)化，從而發(fā)揮抗炎和神經(jīng)保護作用。

綜上所述，筆者認為IL-4在小膠質(zhì)細胞的免疫調(diào)控中起重要作用。IL-4可以通過STAT6抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路的活化，調(diào)節(jié)LPS激活的促炎性的M1型小膠質(zhì)細胞向抑炎性和神經(jīng)保護性的M2型的小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化。因此，在CNS損傷性疾病中，如果能夠促進IL-4的產(chǎn)生，則可以通過后者發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，這對中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的修復(fù)具有重要意義。