轉Cry1Ac/1Ab基因棉花對異色瓢蟲生長發育及其捕食功能的影響

朱香鎮， 雒珺瑜， 李笠坤,， 吳益東， 李春花， 崔金杰*

1中國農業科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000；2南京農業大學植物保護學院/昆蟲分子毒力學實驗室，江蘇 南京 210095

近20年來，隨著轉基因棉花在我國大規模的商業化種植，其轉基因技術得到迅猛發展，越來越多的新型基因被導入棉花中，轉基因棉花的種類也蜂擁出現(劉晨曦和吳孔明，2011)，其中復合性狀轉基因棉花、轉特殊基因棉花、轉融合基因棉花等新型轉基因棉花已成為商業化開發的一個重要趨勢。新型轉基因棉花和傳統轉單價基因棉花一樣，大規模的種植可能會對生態環境產生潛在的影響，因此，在商業化種植前對新型轉基因棉花的環境安全性評價顯得尤為重要。

環境安全性評價主要包括靶標昆蟲對轉基因棉花產生的抗性、轉基因作物的雜草化趨勢、基因漂流、對有益昆蟲和天敵生物以及生物多樣性的影響等問題(錢迎倩等，2001； 吳孔明，2007； Hails,2000)。異色瓢蟲Harmoniaaxyridis(Pallas)作為一種捕食性很強的天敵生物廣泛存在于農田生態系統中(王甦等，2007)，其捕食對象包括各種蚜蟲、葉螨和介殼蟲等同翅目昆蟲以及鞘翅目、膜翅目、雙翅目和鱗翅目昆蟲的幼蟲和蛹(Dixon,2000; Obrycki & Kring,1998)。捕食性天敵在維持田間生態平衡和復雜的生態鏈鎖方面起著重要作用；而當轉基因作物種植后，植物體內或組織上表達出異源蛋白或毒蛋白如花粉、花蜜、葉片等，被害蟲取食后，影響害蟲的生長發育和繁殖等，最終導致天敵生物獵物質量與數量改變(Harwoodetal.,2005; Zwahlen & Andow,2005)。通過三級營養關系評估轉基因作物對天敵生物生長發育影響以及對農田害蟲的捕食和控制作用已在轉基因水稻、玉米、棉花等作物上成為研究熱點(lvarez-Alfagemeetal.,2009; Hanetal.,2014; Romeisetal.,2004)。

丁瑞豐等(2016)以轉Bt+CpTI基因抗蟲棉花及其親本為材料對棉花—棉蚜AphisgossypiiGlover —普通草蛉Chrysoperlacarnea(Stephens)三級營養關系進行研究，結果表明轉基因棉花對普通草蛉捕食功能反應和搜尋效應沒有顯著的影響；施敏娟(2012)研究發現轉Bt基因抗蟲棉對中華草蛉ChrysoperlasinicaTjeder的生長發育和繁殖無不良影響，并且ELISA檢驗的結果顯示,中華草蛉體內不含Bt毒蛋白，說明Bt毒蛋白不會經過棉蚜傳至其天敵中華草蛉體內；對捕食性天敵草間小黑蛛Erigonidiumgraminicolum利用棉花—棉鈴蟲—草間小黑蛛三級營養關系的研究表明，轉Cry1Ac+Cry2Ab基因棉花對草間小黑蛛體重及其體內外源蛋白含量的影響均不顯著，并且對草間小黑蛛體內相關解毒酶和保護酶活性亦無顯著影響(雒珺瑜等，2013)；還有研究轉Bt基因棉花對煙粉虱Bemisiatabaci(Gennadius)天敵昆蟲龜紋瓢蟲Propyleajaponica(Thunberg)影響時發現，龜紋瓢蟲對煙粉虱的捕食功能符合HollingⅡ型反應，并且轉Bt基因棉花上的煙粉虱對龜紋瓢蟲的發育歷期和存活率沒有明顯的影響(周福才等，2013)。

本研究以轉Cry1Ac/1Ab基因棉花為實驗對象，以其常規親本棉為對照，研究飼喂不同棉花的初孵棉鈴蟲對天敵生物異色瓢蟲生長發育的影響，以及不同齡期異色瓢蟲對初孵棉鈴蟲的捕食功能，旨在探索我國轉新型基因棉花的環境安全評價理論與方法，同時為我國轉基因棉花對天敵生物安全性評價提供更多的參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試棉花

轉Cry1Ac/1Ab基因棉花品系(A26-5)和其親本常規棉花品系(J14)由創世紀種業公司提供，種植在中國農業科學院棉花研究所東場實驗田內，供試棉花葉片為直接在實驗田塊A26-5和J14采集的倒三葉。整個實驗過程中田間未使用任何化學農藥。

1.2 供試昆蟲及飼養方法

異色瓢蟲采集于非轉基因棉田，在室內經人工飼養至產卵后，將瓢蟲卵放在透明并帶有透氣孔的塑料盒內(直徑9 cm，高10 cm)，置于光照培養箱[溫度(26±1) ℃，濕度 60%～70%，L/D=14/10]待孵化；棉鈴蟲由中國農業科學院棉花研究所提供，在室內利用人工飼料飼養多代且未使用任何農藥。

1.3 飼喂轉基因棉花的棉鈴蟲對異色瓢蟲生長發育及體重的影響

在第二代棉鈴蟲發生期(棉花生長的蕾期)，采集不同棉花品種的上部倒三葉，飼喂初孵棉鈴蟲幼蟲后備用。選擇體型大小一致的棉鈴蟲幼蟲用于異色瓢蟲捕食功能實驗，轉基因棉花對棉鈴蟲幼蟲的生長發育具有抑制作用，因此，幼蟲飼喂轉基因棉花24 h,飼喂對照葉片12 h。初孵異色瓢蟲幼蟲每20頭為一組，瓢蟲幼蟲在20 mm × 100 mm小試管中單頭飼養，重復3次。瓢蟲用初孵棉鈴蟲飼喂，每天更換棉鈴蟲初孵幼蟲；小試管內事先放入清潔紙條和保濕的棉球，每天更換一次。觀察其生長發育，記錄蛻皮情況，用1/100000的天平對蛻皮后的瓢蟲稱重，直到所有供試瓢蟲產卵結束為止。

1.4 飼喂轉基因棉花的棉鈴蟲對異色瓢蟲捕食功能反應的影響

異色瓢蟲的捕食功能反應以取食不同轉基因棉花的棉鈴蟲初孵幼蟲為獵物，并在室內統一饑餓12 h后進行實驗；在5個塑料盒中分別放置5、10、15、20、25頭棉鈴蟲初孵幼蟲，然后分別放入1頭異色瓢蟲1齡幼蟲，每個密度設置5個塑料盒為1次重復，實驗共重復3次；透明塑料盒的直徑為9 cm，高為10 cm，置于光照培養箱中培養。對于異色瓢蟲2、3和4齡幼蟲的捕食功能反應模型，實驗步驟同異色瓢蟲1齡幼蟲，只是設置的初孵棉鈴蟲的密度不同。對于異色瓢蟲2齡幼蟲，設置的5個棉鈴蟲初孵幼蟲密度分別為10、20、30、40和50頭；對于異色瓢蟲3齡幼蟲，設置的5個棉鈴蟲初孵幼蟲密度分別為15、30、45、60和75頭；對于異色瓢蟲4齡幼蟲，設置的5個棉鈴蟲初孵幼蟲密度分別為30、45、60、75和90頭。24 h后記錄取食棉鈴蟲幼蟲個數，并建立捕食功能反應模型——HollingⅡ型反應模型。功能反應圓盤方程為：1/Na=1/(aT)×1/N+Th/T。式中：Na為被捕食的獵物數量；N為獵物密度；a為瞬時攻擊率；T為實驗持續時間(1 d)；Th為處置1頭獵物時間。

1.5 數據分析方法

所有數據運用SPSS 12.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析(One-way analysis，ANOVA)和Duncan′s 差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 轉基因棉花對異色瓢蟲生長發育及體重的影響

2.1.1 轉基因棉花對異色瓢蟲幼蟲發育歷期的影響 如表1所示，與常規親本棉相比，取食飼喂轉基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲幼蟲的異色瓢蟲幼蟲發育至2齡時間縮短0.33 d，差異不顯著(P>0.05)，但發育至3、4齡、蛹期時間均被延長，分別延長0.30、0.57、0.23 d，差異均不顯著(P>0.05)；異色瓢蟲幼蟲從1齡發育至化蛹期時間延長0.77 d，但差異不顯著(P>0.05)。

2.1.2 轉基因棉花對異色瓢蟲幼蟲體重的影響 如表2所示，與常規親本棉相比，取食飼喂轉基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲的異色瓢蟲幼蟲，除1齡幼蟲體重增加0.0773 mg外，其余各齡期幼蟲體重均有所下降，但差異均不顯著(P>0.05)。

表1 不同棉花品種對異色瓢蟲幼蟲發育歷期的影響Table 1 Response of developmental duration of H.axyridis larvae to the varieties of cotton

表2 不同棉花品種對不同齡期異色瓢蟲幼蟲體重的影響Table 1 Body weight of H.axyridis larvae fed with the two cotton varieties

2.2 轉基因棉花對異色瓢蟲捕食功能反應的影響

異色瓢蟲1、2、3、4齡幼蟲對初孵棉鈴蟲捕食量均隨棉鈴蟲密度的增加而增加，當棉鈴蟲密度達到一定限度后不再增加(圖1)。各齡期異色瓢蟲幼蟲對飼喂不同棉花品種的初孵棉鈴蟲捕食功能均符合HollingⅡ型反應。通過捕食功能反應模型擬合實驗數據(表3)，不同齡期的異色瓢蟲幼蟲對初孵棉鈴蟲的功能反應相關系數均高于0.9284，達顯著相關水平，說明實驗得到的數據模型能反應不同齡期異色瓢蟲在不同棉鈴蟲密度下的捕食規律。隨著異色瓢蟲齡期的增長，其對飼喂2種棉花的棉鈴蟲瞬間攻擊率加快，即異色瓢蟲1齡時對飼喂A26-5和J14棉花的棉鈴蟲攻擊率分別為0.8818和0.8173，而至4齡時瞬間攻擊率達到0.9521和0.9992；隨著異色瓢蟲齡期的增長，其對棉鈴蟲的處理時間逐漸縮短，即異色瓢蟲取食飼喂A26-5和J14棉花的棉鈴蟲的處理時間從1齡的0.0161和0.0172 h減少到4齡的0.0026和0.0043 h，但異色瓢蟲對飼喂2種棉花的棉鈴蟲的瞬間攻擊率和處理時間差異均不顯著(P>0.05)。

3 討論

轉基因作物的出現，一方面使農業生產成本大幅度降低并且有效地提升了品質和產量，另一方面卻給生態環境安全帶來不確定性和不穩定性。研究表明，轉基因作物對生態環境安全的影響最為重要的是其對非靶標生物的影響(Conneretal.,2003; Paul,2002)。實驗結果表明，與常規親本棉相比，轉Cry1Ac/1Ab基因棉對異色瓢蟲生長發育歷期無顯著影響，取食飼喂轉基因棉花葉片的初孵棉鈴蟲的異色瓢蟲幼蟲，除1齡幼蟲體重增加外，其余各齡期幼蟲體重均有所下降，但差異均不顯著，與雒珺瑜等(2013)、Hanetal.(2014)、Zhuetal.(2006)的研究結果一致。本實驗是捕食性天敵通過三級營養間接取食轉基因作物，因此直接或間接取食轉基因作物是否增加或減輕捕食性天敵的體重還需進一步研究(Sayyedetal.，2003)。

圖1 不同齡期異色瓢蟲對飼喂不同棉花初孵棉鈴蟲的捕食功能反應曲線Fig.1 The response curves of H.axyridis larvae preying on bollworms feeding in different cotton varieties A：異色瓢蟲1齡幼蟲；B：異色瓢蟲2齡幼蟲；C：異色瓢蟲3齡幼蟲；D：異色瓢蟲4齡幼蟲。 A: 1st instar H.axyridis larva; B: 2nd instar H.axyridis larva; C: 3rd instar H.axyridis larva; D: 4th instar H.axyridis larva.

齡期Stages棉花品種Cotton variety瞬時攻擊率(a)Instantaneous attack rate處理時間(Th)Handling time/s功能方程Function equationR21齡A26-50.8818±0.07610.0161±0.0025Na=0.8818N/(1+0.1446N)0.95941st instarJ140.8173±0.09690.0172±0.0047Na=0.8173N/(1+0.0156N)0.94202齡 A26-51.1580±0.02560.0136±0.0004Na=1.1580N/(1+0.2223N)0.99282nd instar J141.2069±0.01610.0152±0.0007Na=1.2069N/(1+0.2122N)0.99313齡 A26-51.0058±0.02450.0039±0.0007Na=1.0058N/(1+0.0040N)0.93243rd instar J141.0361±0.02390.0069±0.0012Na=1.0361N/(1+0.0072N)0.92844齡 A26-50.9521±0.02370.0026±0.0004Na=0.9521N/(1+0.0025N)0.96704th instar J140.9992±0.05250.0043±0.0010Na=0.9992N/(1+0.0045N)0.9716

攝取轉基因產物的生物可能將未改變的轉基因產物從植物傳遞給捕食者，而且生物能夠通過自身的代謝潛在改變其生物化學活性并對捕食者產生某些不利的影響(Andow & Hilbeck，2004)，其中包括對捕食性天敵捕食能力及功能反應的影響。功能反應(functional response)是捕食者對獵物的捕食效應，指環境中獵物密度的變化使獵物捕食率發生改變的一種反應，可用于鑒別捕食者對獵物的選擇性以及生物防治中對敵害控制作用和轉基因環境安全性評價的指標(Fernandez-arhex & Corley,2003; Murdochetal.,2003)。謝修慶等(2012)利用轉Bt基因棉花、轉Bt+CpTI基因棉花、常規棉為材料，研究了取食不同棉花品種的棉蚜對龜紋瓢蟲1～4齡幼蟲功能反應的影響，結果表明龜紋瓢蟲對不同品種棉花上棉蚜的捕食量隨獵物密度的增加而增大，均符合HollingⅡ圓盤方程，但對來自轉基因棉田蚜蟲的捕食量大多高于常規棉田，表明龜紋瓢蟲對 Bt棉上的棉蚜并不存在排斥性。中華草蛉對取食轉基因棉的甜菜夜蛾的捕食功能反應研究結果表明，與常規棉相比，中華草蛉對用轉基因棉處理的甜菜夜蛾的捕食量和捕食效率均高于對照，但其捕食功能反應均符合HollingⅡ型(施敏娟等，2011)。

本研究表明，各齡期異色瓢蟲幼蟲對飼喂不同棉花初孵棉鈴蟲捕食功能反應均符合HollingⅡ圓盤方程，與常規棉相比，飼喂取食轉Cry1Ac/1Ab基因棉花棉鈴蟲對異色瓢蟲捕食功能無顯著差異。但本研究是在室內條件下進行的，由于棉田自然環境因素復雜，害蟲種類繁多，溫度、濕度、光周期等多種因子在天敵捕食害蟲過程起到某些干擾作用。因此，需進一步在棉田環境條件下研究異色瓢蟲對棉鈴蟲的捕食能力；同時，轉基因棉對其他天敵的影響還應進一步研究與完善。