IPV-D抗原檢測試劑參考品的制備及標定

譚振國 龍潤鄉 楊 蓉 羅芳宇 李 華 謝天宏 楊 婷 岳 磊 謝忠平

脊髓灰質炎是由3種血清型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)脊髓灰質炎病毒(poliovirus，PV)中任意一型引起的急性傳染病。PV侵入中樞神經系統，并在脊髓前角細胞復制，引起麻痹型脊灰病例。目前 PV 在巴基斯坦、阿富汗、尼日利亞和印度仍有傳播,使我國脊灰野病毒輸入性風險持續存在[1,2]。2011年我國新疆維吾爾自治區發生了由巴基斯坦輸入的脊髓灰質炎野病毒引起的暴發疫情[3～6]。全球消滅脊灰形勢不容樂觀，尤其是與我國相鄰國家脊灰疫情呈高發態勢，我國發生脊灰野毒株(WPV) 輸入的風險增大[7，8]。根據世界衛生組織要求，2008年停止使用脊髓灰質炎減毒活疫苗(OPV)，屆時需要使用脊髓灰質炎滅活疫苗(IPV)來維持脊灰的免疫水平，直到脊灰病毒消失，不再對人類健康構成威脅[9]。隨著全球首劑Sabin株IPV在中國醫學科學院醫學生物學研究所研制成功，IPV的生產已成為防控脊灰感染流行，維持人群高免疫水平的關鍵[10]。無論疫苗的生產，還是臨床檢測都會用到相應的抗原檢測試劑，為獲得質量可靠、性能穩定的檢測試劑，對檢測試劑進行質量控制是必須的。在此前提下，筆者單位制備及標定了3套分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV抗原檢測試劑的參考品，用于IPV-D抗原檢測試劑的質控，現將結果報道如下。

材料與方法

1.參考品的組成:Ⅰ型參考品包含10份陽參、10份陰參、1份靈敏度參考品，1份精密性參考品；Ⅱ型參考品包含10份陽參、10份陰參、1份靈敏度參考品，1份精密性參考品；Ⅲ型參考品包含10份陽參、10份陰參、1份靈敏度參考品，1份精密性參考品。(1)陽性參考品(陽參):經組織培養得到IPV-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個型別的病毒收獲液，各型別病毒收獲液經甲醛滅活后按不同濃度進行稀釋，制備成10份陽性參考品。各型別陽性參考品經核酸檢測確認，酶標檢測無型別交叉。(2)陰性參考品(陰參):非Polio腸道病毒7份，其他型別IPV-D抗原2份，本型別IPV-C抗原1份。IPV病毒原液56℃ 90min，D抗原可轉為C抗原。(3)靈敏度參考品:IPV-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒原液加入2%BSA作為保護劑，經酶標檢測無交叉。(4)精密性參考品：病毒原液按不同濃度進行稀釋，選取吸光度值為0.6～0.8濃度稀釋后備用。

表1 陰性參考品的組成

2.國家標準品:Sabin株脊髓灰質炎效力檢測國家參考品，批號201301。

3.試劑:本室制備的IPV-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型D抗原檢測試劑盒，批號20151117。

4.設備:離心機，水浴鍋，隔水式恒溫培養箱，二氧化碳培養箱，酶標儀。

5.檢測方法:使用本室制備的IPV-D抗原檢測試劑盒(ELISA法)檢測，國家抗原含量參考品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均稀釋至8U/ml后，在板上作2倍系列稀釋；待標靈敏度參考品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型均按1∶200稀釋后，在板上作2倍系列稀釋；每型別陰參10份，每份1孔；陽參10孔，每份1孔；每型別精密性參考品1份，連加10孔。待測樣品100毫升/孔，設陰性2孔、陽性2孔、空白1孔，各型待標參考品分別加入IPV-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原檢測板中， 37℃保溫2h；0.01MPBST洗板5次，分別加入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV-HRP，100毫升/孔，37℃保溫1h；0.01MPBST洗板5次，TMB37℃顯色10min終止反應。在450nm波長處測量樣品吸光度值(A值)。

6.穩定性試驗:(1)熱穩定性試驗:將3套參考品37℃放置3天、5天后，取出檢測。(2)凍融試驗:將3套參考品反復凍融3次、5次后，取出檢測。

結 果

1.陽性參考品標定結果:使用3批次IPV抗原檢測試劑、9人次對10份陽性參考品進行檢測，檢測結果均為陽性，陽性參考品符合率為100%，見表2。

表2 陽性參考品標定結果

2.陰性參考品標定結果:3批9人次檢測結果，7種非IPV-I型的腸道病毒均沒有檢出，對IPV-Ⅰ型C抗原及IPV-Ⅱ、Ⅲ型病毒液進行檢測，未發現有交叉反應，10份陰性參考品符合率為100%，結果表明本試劑具有良好的特異性，見表3。

表3 陰性參考品標定結果

3.靈敏度參考品標定結果:使用IPV抗原檢測試劑、9人次分別對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型靈敏度參考品進行標定。Ⅰ型靈敏度參考品平均含量參為1413.13DU/ml，95%CI:1329.63～1496.62DU/ml，9次檢測值均在此范圍內，待標品檢測r2值范圍為0.97～1.00，平均值為0.99；Ⅱ型靈敏度參考品平均含量參為1684.66DU/ml，95%CI:1499.21～1870.12DU/ml，9次檢測值均在此范圍內，待標品檢測r2范圍0.98～1.00，平均值為0.99；Ⅲ型靈敏度參考品平均含量參為1561.95DU/ml，95%CI:1313.80～1810.10DU/ml,9次檢測值均在此范圍內，待標品檢測r2范圍0.95～1.00，平均值為0.98。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型靈敏度參考品r2均>0.95，顯示標定線性值較好，符合檢測試劑對線性的要求,見表4。

表4 靈敏度參考品標定結果

4.精密性參考品標定結果:檢測試劑的精密度用變異系數來衡量。在板上連加10孔精密性參考品，其變異系數(CV，%)=[標準差(SD)/平均值(X)]×100%。9人次檢測結果顯示Ⅰ型精密度參考品CV值范圍在2.57%～7.15%，平均值為4.52%；Ⅱ型精密度參考品CV值范圍為4.56%～9.07%，平均值為6.54%；Ⅲ型精密度參考品CV值范圍為2.37%～9.87%，平均值為5.68%。各批次CV值均小于15%，符合檢測試劑對精密度要求，見表5。

表5 精密性參考品標定結果(%)

5.穩定性實驗結果：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型待標參考品在37℃加速破壞試驗或凍融試驗后，10份陽參均為陽性，10份陰參均為陰性，精密性參考品的CV值均小于15%，靈敏度參考品的檢測下限與-70℃對照組比較，未見下降，各型靈敏度參考品線性良好，均>0.95。各型參考品檢測指標均符合質量要求，見表6。

討 論

酶聯免疫吸附試驗抗原抗體的結合不是一種簡單的化學反應，而是一種生物反應，方法本身變異性較大。生物標準物質是用生物方法實驗時，使其表示的效價或活性由不同地點、不同條件、不同操作者得出相對一致性結果的一種工具。因此，標準物質作為生物制品生產檢定中必不可少的重要組成部分，在生物制品質量控制和效力評價中發揮重要作用[11]。診斷試劑參考品一般從靈敏度、特異性、精確性、穩定性4個方面進行考察[12,13]。本研究的陽性參考品使用高、中、低不同濃度的病毒原液制備，其目的在于高濃度的陽參用于防止抗原濃度過高引起鉤狀效應的存在，而使檢測出假陰性。低濃度的陽參則是針對弱陽性樣品是否能被檢出而設置；陰性參考品包含了7份非Polio其他腸道病毒、2份其他型別Polio病毒、1份本型別polio-C抗原。由于腸道病毒之間有較高的同源性，一般抗原檢測容易出現交叉反應，筆者選擇了ECHO6、 CoxB3、 CoxB5、CoxA16、 ECHO2、CoxA 7、HAV 7種病毒的標準株及疫苗株，以此來排除腸道病毒對IPV-D抗原檢測的干擾[12]。使用其他2個型別的Polio病毒，用于檢測是否存在型間交叉。Polio病毒有D、C兩種抗原，C抗原不能刺激機體產生中和抗體，只有D抗原能刺激機體產生保護性抗體，D抗原可作為IPV體外效力測定的重要指標，它與體內免疫原性有效好的一致關系[9]。因此，陰參中設置的本型別polio-C抗原，用于檢測疫苗中是否含有無效的C抗原。

表6 Ⅰ型參考品穩定性試驗結果

表7 Ⅱ型參考品穩定性試驗結果

表8 Ⅲ型參考品穩定性試驗結果

通過標定靈敏度參考品的含量，在檢測過程中一方面可以監測試劑盒的檢測下限，另一方面還可以通過已知含量的參考品來計算未知樣品的含量。根據國家藥典對診斷試劑的要求，用于酶聯診斷試劑的精密度(CV值)應不高于15%(n=10)[14]。本研究標定的精密性參考品選取檢測吸光度值0.6～0.8的樣品來控制檢測試劑的孔間差。

穩定性是標準物質的特性量值隨時間變化的性質，即在規定的時間間隔和環境條件下，標準物質的特性量值報紙在規定范圍的性質[15]。考慮到參考品在保存、使用、運輸過程中可能出現的情況，筆者設計了熱穩定性試驗和凍融試驗對參考品的穩定性進行考察。實驗結果顯示，37℃放置5天或凍融3次仍可達到質控參考品的合格標準，通過分別使用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型IPV-D抗原檢測試劑對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型抗原參考品進行檢測，結果均符合參考品的要求。

綜上所述，由本室制備的IPV-D抗原的3個型別的參考品是成功的，能夠對IPV-D抗原檢測試劑的質量控制起到重要的作用，對疫苗的質量提供了有效保障。