NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路在HK-2細(xì)胞高糖缺氧復(fù)氧損傷中的作用

肖業(yè)達(dá) 黃亞醫(yī) 黃 婷 汪華新 趙 博 王雅楓

腎缺血再灌注損傷是臨床上最為常見(jiàn)的病理生理現(xiàn)象，其可發(fā)生于嚴(yán)重的創(chuàng)傷、休克和感染等情況[1]。而大宗臨床研究表明：糖尿病患者腎缺血再灌注損傷發(fā)生率更高，預(yù)后更差[2]。因此糖尿病腎缺血再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制及其防治策略成為亟待解決的臨床熱點(diǎn)之一。

寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體(nod-like receptor, NLRs)是在宿主先天性免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞內(nèi)特異性蛋白，可以識(shí)別胞質(zhì)內(nèi)的病原相關(guān)分子。炎性復(fù)合體概念最早由Tschopp于2002年提出，炎性復(fù)合體結(jié)構(gòu)包括凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白，半胱天冬酶1前體(pro-caspase-1)和一種NLRs。其中NLRP3是目前結(jié)構(gòu)功能研究最多的炎性體。當(dāng)NLRP3被激活后，可以使pro-caspase 1裂解為有活性的cleaved-caspase-1，從而進(jìn)一步促進(jìn)炎性因子前體成熟，轉(zhuǎn)化為有活性的IL-1β和IL-18[3]。研究表明NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路在腎缺血再灌注損傷中發(fā)揮了重要作用[4,5]。同時(shí)相關(guān)研究表明NLRP3參與了糖尿病腎病的發(fā)生和進(jìn)展[6，7]。而該信號(hào)通路在糖尿病腎臟缺血再灌注損傷的研究中尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)建立HK-2細(xì)胞高糖缺氧復(fù)氧模型，觀察NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路在HK-2細(xì)胞損傷中的變化。

材料與方法

1.材料：人腎小管上皮細(xì)胞HK-2購(gòu)自美國(guó)ATCC公司，DMEM低糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，CCK-8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，caspase-1活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，活性氧(ROS)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，IL-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，NLRP3抗體購(gòu)自美國(guó)Nous公司，NLRP3抑制劑BAY11-7085購(gòu)自中國(guó)上海藍(lán)木化工有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及分組：HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素和0.1g/L鏈霉素的DMEM低糖培養(yǎng)基(葡萄糖濃度5.5mmol/L)，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%，用含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化細(xì)胞，吹打并傳代。采用數(shù)字表法將HK-2細(xì)胞隨機(jī)分為低糖組(NG組)、低糖缺氧復(fù)氧組(NHR組)、高糖組(HG組)、高糖缺氧復(fù)氧組(HHR組)和高糖缺氧復(fù)氧+NLRP3抑制劑BAY11-7085組(HHR-BAY)。高糖模型的建立：HK-2細(xì)胞鋪板用無(wú)血清低糖DMEM培養(yǎng)基同步化24h后加入高糖(葡萄糖終濃度30mmol/L)培養(yǎng)72h。高糖缺氧復(fù)氧模型的建立：HHR組高糖(30mmol/L)培養(yǎng)72h后進(jìn)行缺氧4h，復(fù)氧2h處理。HHR-BAY組予以NLRP3抑制劑BAY11-7085 5μmol/L與高糖同時(shí)作用72h后缺氧復(fù)氧[8]。

3.指標(biāo)檢測(cè)：(1)根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)，酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞CCK-8、SOD。(2)ELISA法檢測(cè)IL-1β和caspase-1。(3)免疫熒光檢測(cè)NLRP3：PBS浸洗爬好細(xì)胞的玻片3min×3次；4%多聚甲醛固定；0.5%Triton X-100室溫通透20min；血清室溫封閉30min；滴加一抗(NLRP3：1∶50)，4℃孵育過(guò)夜；加熒光二抗(1∶100)，濕盒中室溫孵育1h；滴加DAPI避光孵育5min，進(jìn)行染核；用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。(4)免疫印跡法檢測(cè)NLRP3：冰上裂解細(xì)胞，蛋白定量，電泳后轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入NLRP3一抗(1∶200)過(guò)夜，TBST洗滌3次，10分鐘/次，加入二抗，室溫孵育2h，TBST洗滌3次，10分鐘/次，發(fā)光液將PVDF膜顯色，暗室曝光，掃描灰度值，分析結(jié)果。(5)采用DCHF-DA活性氧檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平。將HK-2細(xì)胞接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁80%時(shí)更換無(wú)血清培養(yǎng)基同步化后按實(shí)驗(yàn)分組處理后，根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀檢測(cè)485/525nm下的熒光強(qiáng)度。測(cè)定結(jié)果以熒光強(qiáng)度/毫克蛋白表示。

結(jié) 果

1.SOD活性：與低糖組比較，高糖組和低糖缺氧復(fù)氧組細(xì)胞存活率顯著降低，ROS含量升高，SOD活性降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖缺氧復(fù)氧組ROS含量明顯升高，細(xì)胞存活率，SOD活性明顯降低(P<0.05)；并且與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組ROS含量進(jìn)一步明顯升高，細(xì)胞存活率，SOD活性進(jìn)一步明顯降低(P<0.05)；與高糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧-BAY組ROS含量明顯降低，細(xì)胞存活率，SOD活性明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 5組細(xì)胞細(xì)胞存活率、SOD活性、ROS水平的比較

2.caspase-1活性：與低糖組比較，高糖組和低糖缺氧復(fù)氧組caspase-1活性，IL-1β含量均升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖缺氧復(fù)氧組caspase-1活性，IL-1β含量均升高(P<0.05)；與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組IL-1β含量，caspase-1活性升高更為顯著(P<0.05)；與高糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧-BAY組caspase-1，IL-1β均顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 5組細(xì)胞caspase-1活性，IL-1β水平的比較

3.Western blot法檢測(cè)：與低糖組比較，高糖組和低糖缺氧復(fù)氧組NLRP3蛋白表達(dá)均升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖缺氧復(fù)氧組NLRP3蛋白表達(dá)含量均升高(P<0.05)；與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組NLRP3蛋白表達(dá)升高更為顯著(P<0.05)；與高糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧-BAY組NLRP3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞NLRP3蛋白表達(dá)水平

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示高糖刺激與缺氧復(fù)氧均可以誘導(dǎo)NLRP3蛋白表達(dá)，與低糖缺氧復(fù)氧組比較，高糖缺氧復(fù)氧組NLRP3表達(dá)升高，而NLRP3抑制劑BAY11-7082可在高糖缺氧復(fù)氧條件下抑制NLRP3表達(dá)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組細(xì)胞NLRP3蛋白免疫熒光結(jié)果(×200)

討 論

缺血導(dǎo)致的低灌注和膿毒血癥是人類(lèi)急性腎損傷的最常見(jiàn)原因[9]。腎臟接受心排出血液量的25%，因此無(wú)論是體循環(huán)還是腎循環(huán)的衰竭都將會(huì)對(duì)腎灌注造成嚴(yán)重影響，導(dǎo)致缺血再灌注損傷[10]。腎缺血再灌注損傷可導(dǎo)致腎臟細(xì)胞廣泛或局部的氧供失衡及代謝物排出障礙，這種代謝失衡會(huì)導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷[11]。

糖尿病可以增加機(jī)體氧化應(yīng)激水平，導(dǎo)致活性氧自由基水平增高，而活性氧的增多又可進(jìn)一步導(dǎo)致機(jī)體更為嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[12]。研究表明，高糖會(huì)導(dǎo)致腎間質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞的活性氧自由基水平上升，使機(jī)體處于高氧化應(yīng)激和強(qiáng)炎性反應(yīng)狀態(tài)[13,14]。而慢性氧化應(yīng)激可以消除麻醉預(yù)處理和缺血預(yù)處理對(duì)缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[15,16]。故氧化應(yīng)激反應(yīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)通路激活對(duì)糖尿病腎缺血再灌注損傷的作用機(jī)制是臨床研究的熱點(diǎn)。

大量報(bào)道表明糖尿病患者腎臟缺血再灌注損傷明顯加重[17]。高血糖可以加重細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，細(xì)胞在高糖環(huán)境下缺氧復(fù)氧損傷的易感性增加[8,18]。本研究采取高糖刺激HK-2細(xì)胞72h，缺氧4h復(fù)氧2h模擬糖尿病缺血性腎損傷[19]。結(jié)果顯示，高糖刺激72h后，HK-2細(xì)胞CCK-8結(jié)果顯示細(xì)胞活性顯著下降。再進(jìn)行缺氧(4h)復(fù)氧(2h)處理，CCK-8結(jié)果顯示高糖缺氧復(fù)氧致細(xì)胞損傷較低糖缺氧復(fù)氧明顯進(jìn)一步加重，顯示了細(xì)胞對(duì)高糖狀態(tài)下缺氧復(fù)氧損傷的易感性。同時(shí)高糖刺激下細(xì)胞氧化應(yīng)激水平顯著上升，表現(xiàn)為ROS大量生成，SOD活性下降。同時(shí)在缺氧復(fù)氧處理后，高糖組較低糖組氧化應(yīng)激水平進(jìn)一步顯著上升。證實(shí)了高糖合并缺氧復(fù)氧會(huì)進(jìn)一步破壞細(xì)胞氧化/還原平衡，刺激細(xì)胞氧化應(yīng)激水平上升，導(dǎo)致更為嚴(yán)重的損傷。筆者由此推測(cè)：細(xì)胞氧化還原調(diào)節(jié)系統(tǒng)失衡是導(dǎo)致高糖缺氧復(fù)氧致細(xì)胞損傷加重的重要作用機(jī)制之一。

NLRP3的激活參與了多種疾病的發(fā)生、發(fā)展，包括代謝綜合征和腎臟疾病[20,21]。大量研究表明鉀離子外流，溶酶體破裂和ROS均可以激活NLRP3，其中細(xì)胞內(nèi)ROS的生成是激活NLRP3的關(guān)鍵因素[22]。NLRP-3激活致caspase-1/IL-1β活化，而IL-1β在腎缺血再灌注病理進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用[23]。本研究免疫熒光和Western blot法檢測(cè)蛋白結(jié)果顯示，NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)軸在高糖或低糖缺氧復(fù)氧條件下顯著上調(diào)，并且在高糖缺氧復(fù)氧條件下進(jìn)一步顯著上調(diào)。說(shuō)明NLRP3在糖尿病缺血性急性腎損傷機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

為進(jìn)一步探討NLRP3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路是否參與高糖缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞損傷的過(guò)程，本研究觀察了NLRP3抑制劑BAY11-7082對(duì)高糖缺氧復(fù)氧對(duì)細(xì)胞損傷作用的影響。BAY11-7082可抑制NLRP3激活，進(jìn)而阻斷其下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制其相應(yīng)的生理病理效應(yīng)[8,24]。研究結(jié)果顯示BAY11-7082可有效抑制高糖缺氧復(fù)氧損傷HK-2細(xì)胞的過(guò)程，顯著提高細(xì)胞存活率，減少NLRP3蛋白的表達(dá)及caspase-1活性和IL-1β含量，抑制氧化應(yīng)激水平。為深入闡明抑制NLRP-3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路的激活可能是降低氧化應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵之一提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

綜上所述，高糖缺氧復(fù)氧致HK-2細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，NLRP-3/caspase-1/IL-1β信號(hào)通路上調(diào)，可能是高糖缺氧復(fù)氧導(dǎo)致細(xì)胞損傷惡化的重要機(jī)制,為將來(lái)預(yù)防治療圍術(shù)期糖尿病腎缺血再灌注損傷提供新的靶點(diǎn)。