淫羊藿苷通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)卵巢癌細(xì)胞CAOV3增殖的影響

陳 茹 蘇 瑩 柳 江

在婦科惡性腫瘤中，卵巢癌屬于高發(fā)類(lèi)型，在全球范圍內(nèi)，卵巢癌在女性癌癥病死率中占第15位[1]。近年來(lái)卵巢癌的發(fā)生率呈逐年升高的趨勢(shì)，并且其具有病程發(fā)展迅速，病死率高的特點(diǎn)。由于卵巢癌在早期沒(méi)有典型的臨床病癥、腫瘤細(xì)胞增殖速度迅速及惡化程度極高、沒(méi)有準(zhǔn)確性較高的腫瘤標(biāo)志物等有效的篩查手段等原因，在確診卵巢癌時(shí)已經(jīng)有約70%的病例處于晚期[2]。目前，臨床上對(duì)于卵巢癌的治療手段多數(shù)以手術(shù)為主化療為輔，但治療效果仍然不容樂(lè)觀[3]。

Wnt屬于分泌性糖蛋白家族，是調(diào)控細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移及細(xì)胞極性的關(guān)鍵信號(hào)分子。當(dāng)Wnt信號(hào)通路發(fā)生異常調(diào)節(jié)時(shí)，可引起免疫機(jī)制的失衡，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。β-catenin屬于一種多功能胞質(zhì)蛋白，在Wnt信號(hào)通路中起到重要作用，不僅是Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)，還是上皮鈣黏素復(fù)合體的主要成分[5～7]。在生理狀態(tài)下，胞質(zhì)內(nèi)的大部分β-catenin參與細(xì)胞黏附，而當(dāng)Wnt信號(hào)通路激活后可抑制β-catenin的降解及磷酸化，使得多余的β-catenin與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動(dòng)與細(xì)胞增殖有關(guān)的基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄[8～10]。因此，Wnt/β-catenin信號(hào)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。

淫羊藿含有多種藥理活性成分，除了一些必需微量元素外，主要含有生物堿、黃酮類(lèi)等化合物。中藥淫羊藿具有多種藥理活性，如增強(qiáng)性腺功能、提高機(jī)體免疫力、抗氧化延緩衰老等作用，其中淫羊藿苷(icariin)屬黃酮類(lèi)化合物，是淫羊藿的主要活性成分之一[11]。有研究報(bào)道證實(shí)，淫羊藿苷可抑制腫瘤細(xì)胞增殖及惡化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，但關(guān)于淫羊藿苷對(duì)卵巢癌的研究報(bào)道較為少見(jiàn)[12]。

本實(shí)驗(yàn)旨在研究淫羊藿苷對(duì)人卵巢癌細(xì)胞CAOV3生長(zhǎng)抑制及過(guò)程中可能的相關(guān)機(jī)制，為淫羊藿苷在臨床上對(duì)卵巢癌的治療奠定基礎(chǔ)。

資料與方法

1.材料和試劑: 淫羊藿苷、MTT(Sigma，Saint Louis，MO，USA)；人卵巢癌細(xì)胞CAOV3(中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，上海，中國(guó))；GAPDH、β-catenin、c-myc和cyclinD1人一抗、HRP標(biāo)記二抗(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，武漢，中國(guó))；DMEM(Gibco，Carlsbad，CA，USA)；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，引物合成(TaKaRa，大連，中國(guó))；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所，南通市，中國(guó))。

2.細(xì)胞培養(yǎng):人卵巢癌細(xì)胞CAOV3在37℃、5%CO2的條件下孵箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)85%融合時(shí)，胰酶消化處理后，用DMEM(含10%胎牛血清)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，將細(xì)胞目的濃度調(diào)整為2×108/L，計(jì)數(shù)后接種于對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)板中，備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

3.檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率:淫羊藿苷處理細(xì)胞后MTT比色測(cè)定細(xì)胞增殖能力：將細(xì)胞CAOV3接種于96孔板中，濃度為1×105/ml，每孔100μl。24h 后加入淫羊藿苷(終濃度分別為10、20、40、60、80μg/ml)，每個(gè)濃度重復(fù)5個(gè)孔，獨(dú)立重復(fù)6次，對(duì)照組不給藥。在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)孵育24、48 及72h，換去藥液。每孔加入10μl的MTT，濃度為5mg/ml，4h后，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔570 nm波長(zhǎng)的吸光度(A)值。按以下公式計(jì)算細(xì)胞抑制率：抑制率(%)=(正常對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值/正常對(duì)照組A值)×100%。

4.細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察:將人卵巢癌細(xì)胞CAOV3培養(yǎng)好后，分別用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24h，各組用倒置顯微鏡(Nikon，Tokyo，Japan)觀察并拍攝細(xì)胞形態(tài)變化。

5.RT-PCR檢測(cè)β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達(dá):將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于6孔板，104個(gè)細(xì)胞/孔，24h后吸去上清液，分別用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，收集各組細(xì)胞，依照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)中的方法提取待檢組織中的總RNA，采用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本Hitachi公司)檢測(cè)總RNA的濃度和純度(A260/A280>1.8為合格)。然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，再以cDNA為模板，按照RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達(dá)。引物序列如表1所示，反應(yīng)條件為：95℃ 10min，95℃ 15s，60℃ 1min，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。從儀器軟件中輸出Ct值，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量采用2-△Ct方法，按照下列公式計(jì)算：△Ct(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(對(duì)照基因)。

表1 RT-PCR引物序列

6.Western blot法檢測(cè)β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白的表達(dá): 將培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于6孔板，104個(gè)細(xì)胞/孔，24h后吸去上清液，分別用含0、20、40和60μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，收集各組

細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，高速離心機(jī)低溫離心15min，收集上清。用BCA試劑盒測(cè)定提取蛋白濃度，取50μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。封閉液室溫封閉1h，加入一抗孵育(1∶1000)，4℃過(guò)夜。TTBS充分洗膜后，加入二抗(1∶2000)室溫孵育1h，ECL暗室顯影，凝膠成像儀(Bio-Rad Laboratories，California，USA)掃描紀(jì)錄，以GADPH作為內(nèi)參，進(jìn)行灰度分析比較。

結(jié) 果

1.淫羊藿苷對(duì)CAOV3細(xì)胞增殖抑制的影響:分別用含0、10、20、40、60、80μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24、48、72h后，各組中均可顯著抑制CAOV3細(xì)胞的增殖，隨著濃度和時(shí)間的增加，增殖抑制率明顯升高(P<0.01)，并呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴(lài)性。詳見(jiàn)表2。在本研究的后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取20、40、60μg/ml淫羊藿苷作為給藥濃度，作用時(shí)間為24h。

表2 不同濃度淫羊藿苷對(duì)CAOV3細(xì)胞的增殖抑制作用

2.淫羊藿苷對(duì)CAOV3細(xì)胞形態(tài)的影響:如圖1所示，與對(duì)照組比較，分別用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，各組中細(xì)胞形態(tài)明顯改變，細(xì)胞皺縮，貼壁不牢，增殖細(xì)胞數(shù)明顯得到抑制，并且具有明顯的劑量依賴(lài)性。

圖1 不同濃度的淫羊藿苷處理24h后，倒置顯微鏡下觀察淫羊藿苷對(duì)CAOV3細(xì)胞形態(tài)的影響

3.淫羊藿苷對(duì)β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA水平的影響:如圖2所示，分別用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，與對(duì)照組比較，各組中cyclinD1 mRNA 表達(dá)量、c-myc和cyclinD1 mRNA水平均被顯著抑制(P<0.01)。

圖2 RT-PCR檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)CAOV3細(xì)胞β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA的表達(dá)水平的影響

4.淫羊藿苷對(duì)β-catenin、c-myc和cyclinD1 蛋白表達(dá)水平的影響:分別用含20、40、60μg/ml淫羊藿苷的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h后，與對(duì)照組比較，各組中β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白表達(dá)水平也被顯著抑制 (P<0.01)，且具有一定的濃度依賴(lài)性(圖3)。

圖3 Western blot法檢測(cè)淫羊藿苷對(duì)CAOV3細(xì)胞β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白結(jié)果

討 論

卵巢癌以其惡化程度高，病情進(jìn)展迅速為特點(diǎn)，是病死率較高的婦科惡性腫瘤，而早期缺乏有效的篩查手段以及長(zhǎng)期有效的治療方案的缺乏是卵巢癌病死率居高不下的原因。因此，尋找新的有效的治療方法一直以來(lái)都是卵巢癌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

β-catenin作為一種細(xì)胞間的黏附分子，當(dāng)其存在于細(xì)胞膜上時(shí)有參與細(xì)胞黏附的功能，一旦發(fā)生細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位或被降解，黏附活性則消失[13]。有研究表明β-catenin不僅有介導(dǎo)細(xì)胞黏附的功能，還具有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活是人類(lèi)腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，β-catenin的過(guò)度表達(dá)也是此信號(hào)通路激活的主要表現(xiàn)[14]。原癌基因cyclinD1和c-myc，在細(xì)胞的增生、分化與凋亡過(guò)程中起到重要作用，并且與多種腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。近年來(lái)研究顯示，cyclinD1、c-myc在Wnt信號(hào)通路中是非常重要的靶基因，免疫組化研究證實(shí)在多種腫瘤中cyclinD1、c-myc、β-catenin的異常表達(dá)和Wnt信號(hào)通路激活有關(guān)，Wnt信號(hào)途徑激活時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞核的β-catenin增加，進(jìn)一步活化cyclinD1和c-myc等基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖[15，16]。在細(xì)胞核內(nèi)，如果β-catenin異常蓄積并活化基因時(shí)，β-catenin基因就成了癌基因，已有研究證明β-catenin與多種消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生有關(guān)[17]。

本實(shí)驗(yàn)中在卵巢癌細(xì)胞CAOV3中分別加入不同終濃度的淫羊藿苷，24、48及72h后檢測(cè)指標(biāo)。MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，淫羊藿苷能顯著抑制細(xì)胞CAOV3的活性，隨著濃度和時(shí)間的增加，增殖抑制率明顯升高，并呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴(lài)性。淫羊藿為一種常見(jiàn)中藥，具有免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等作用，在大量肝癌、乳腺癌等疾病的研究中淫羊藿苷有明顯的抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用[18，19]。目前，對(duì)淫羊藿苷抑制卵巢癌細(xì)胞CAOV3增殖的作用機(jī)制尚未完全明確，推測(cè)可能是通過(guò)改變CAOV3細(xì)胞膜生化特性、使其細(xì)胞周期相的S期減小，影響其生理活動(dòng)和物質(zhì)代謝進(jìn)而抑制CAOV3細(xì)胞生長(zhǎng)。國(guó)外有相關(guān)研究表明淫羊藿苷可明顯調(diào)節(jié)影響肺癌惡性增殖的JAK2/STAT3信號(hào)通路的活性[20]。結(jié)合本研究結(jié)果，證明淫羊藿苷在體外具有抑制CAOV3細(xì)胞增殖的作用。倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷處理以后，增殖的CAOV3細(xì)胞數(shù)目減少，形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞逐漸皺縮，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)上進(jìn)一步證明淫羊藿苷在體外具有明顯抑制CAOV3細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。分析其原因，可能是隨著淫羊藿苷濃度的增加及藥效的深入，抑制CAOV3細(xì)胞增殖的效果增強(qiáng)，加劇CAOV3細(xì)胞的凋亡，明顯降低其遷徙能力，因而在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞逐漸皺縮并數(shù)目減少。

RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，淫羊藿苷可降低β-catenin mRNA的表達(dá)以及抑制Wnt信號(hào)通路靶基因c-myc和cyclinD1 mRNA的表達(dá)，分析原因可能為cyclinD1為特異性周期蛋白，在正常細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程中起著主要作用，其過(guò)度表達(dá)是多種原發(fā)性惡性腫瘤的特征；c-myc是myc基因家族的重要成員之一，是一種可使細(xì)胞無(wú)限增殖、促進(jìn)細(xì)胞分裂的基因，其低表達(dá)，能使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、促進(jìn)細(xì)胞分化。cyclinD1和c-myc在Wnt信號(hào)通路中起著核心作用，兩者共同影響腫瘤疾病的進(jìn)展，β-catenin基因則主要通過(guò)激活cyclinD1而參與腫瘤的發(fā)生。

淫羊藿苷對(duì)細(xì)胞周期有特異的阻斷作用，能干擾和抑制DNA的復(fù)制與合成，殺傷處于增殖期的細(xì)胞。因此，淫羊藿苷抑制癌細(xì)胞增殖的作用可能是通過(guò)抑制β-catenin、c-myc和cyclinD1 mRNA水平的表達(dá)。Utsuki等[21]對(duì)患者腫瘤組織中cyclinD1和β-catenin的表達(dá)水平進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隨著腫瘤的惡化，cyclinD1和β-catenin的mRNA表達(dá)水平逐漸升高。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞中β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率較正常腎組織明顯升高，說(shuō)明β-catenin、cyclinD1和c-myc mRNA的高表達(dá)在腎母細(xì)胞瘤形成中可能起著重要作用[22]。其研究結(jié)論與本研究相結(jié)合能夠更好的說(shuō)明淫羊藿苷的作用機(jī)制是通過(guò)降低β-catenin、cyclinD1和c-myc的表達(dá)，并且Western blot法檢測(cè)結(jié)果同時(shí)也表明淫羊藿苷可下調(diào)β-catenin、c-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)。表明淫羊藿苷能夠下調(diào)β-catenin、c-myc和cyclinD1蛋白，使其不能與核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖。Li等[23]研究表明，淫羊藿苷能夠通過(guò)作用于microRNA-21進(jìn)而影響PTEN、RECK和Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷抗腫瘤的新的作用機(jī)制，即通過(guò)降低β-catenin、c-myc和cyclinD1的表達(dá)，產(chǎn)生抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為淫羊藿苷對(duì)卵巢癌的藥物治療作用提供一定的理論基礎(chǔ)。

綜上所述，本研究證明淫羊藿苷可以抑制人卵巢癌CAOV3細(xì)胞株的增殖，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。