5-脂氧合酶抑制劑Zileuton緩解壓力負荷誘導的心肌重構

鄧 偉 陳嬌嬌 魏 麗 吳青青 唐其柱

心肌重構是高血壓病、冠心病、瓣膜病等多種心血管疾病發展為心力衰竭的關鍵病理生理過程。雖然現在對心力衰竭的治療由改善血流動力學(強心利尿)進展到系統治療(抑制神經內分泌過度激活，以及心臟再同步化輔助裝置等)，但心力衰竭的發生率和病死率仍居高不下[1]。《中國心力衰竭診斷與治療指南2014》明確指出，心力衰竭的治療目標不僅是改善癥狀，提高生活質量，更重要的是針對心肌重構的機制，防止和延緩心肌重構的發展，從而降低心力衰竭的病死率和住院率。因此，在目前各種治療策略已達到瓶頸的現狀下，探索新的、可能更有效的心肌重構干預靶點，進而遏制心力衰竭的發生、發展，顯得尤為迫切。

炎性因子及免疫信號通路在心肌重構中發揮了重要作用，但白三烯及其相關通路蛋白是否在心肌重構中發揮了作用尚不清楚。5-脂氧合酶(5-Lipoxygenase, 5-LOX)是機體白三烯合成的關鍵酶，它通過經典的免疫調控效應在腫瘤、感染性疾病、慢性阻塞性肺疾病、哮喘等多種疾病進展中發揮了重要作用[2～5]。既往對5-LOX在心血管疾病中的作用研究集中在動脈粥樣硬化和冠心病，但5-LOX對壓力負荷誘導心肌重構的影響國內外尚無報道[6, 7]。在本研究中，筆者應用5-LOX抑制劑Zileuton干預壓力負荷誘導的小鼠心肌重構，擬探討Zileuton對心肌重構和心力衰竭的作用。

對象與方法

1.實驗動物及分組:C57BL/6J(C57)品系的野生型小鼠，購于中國醫學科學院實驗動物研究所，選擇體重24～27g、8～10周齡的雄性小鼠為實驗對象，建立心肌重構小鼠模型，進行觀察和研究。小鼠飼養于獨立送回風凈化籠具(IVC)內，自由進食進水，飲用水經高壓處理，飼料經60Co照射滅菌。系統環境為SPF級，溫度維持在22～24℃，濕度為50%～60%，12h明暗交替。實驗分4組：假手術組(Sham組)包括對照組(Sham-Veh組)和Zileuton干預組(Sham-Zil組)，心肌重構模型組(AB組)也包括對照組(AB-Veh組)和Zileuton干預組(AB-Zil組),每組20只小鼠。

2.心肌重構動物模型制作及干預方法:制作壓力負荷性左心室心肌重構小鼠模型(AB模型組)：經戊巴比妥鈉麻醉小鼠，沿第2～3肋間水平切開皮膚，依次分離肌肉及軟組織，游離胸主動脈，將7-0手術縫線穿過主動脈，將去尖的27號針頭連同主動脈一起結扎，然后立即抽出針頭，造成主動脈70% 狹窄后，逐層縫合切口。假手術組只在分離主動脈后穿過一條短絲線，不作結扎，其他手術步驟同模型組。

Zileuton購自南京康滿林生物科技有限公司，純度98%，每次使用前用0.5%羧甲基纖維素溶液制成新鮮懸液。藥物干預組Zileuton 70mg/kg灌胃，每天1次，術后1周開始，持續至術后7周取材，對照組同時給予等容量溶媒灌胃。

3.心臟超聲檢測:術后8周做心臟超聲檢測。異氟烷吸入性麻醉小鼠，將小鼠左胸前區剃毛，涂抹耦合劑，取左側臥位或仰臥位對小鼠行超聲檢查。采用高頻超聲診斷儀(My lab 30，意大利Esaote公司), 頻率為15MHz，選取標準左心室乳頭肌短軸切面，測量小鼠心率(HR)、舒張末期左心室內徑(LVEDD)、左心室后壁厚度(LVPWD)、室間隔厚度(IVSD)、射血分數(EF)。每組小鼠采集10只小鼠的數據。

4.組織病理學檢測：術后8周取材。取出心臟和肺臟，用濾紙吸干血液后分別稱重，計算心臟重量與體重的比值(HW/BW)，肺臟重量與體重的比值(LW/BW)。每組各取8個心臟加入10倍量4%多聚甲醛固定后24h后, 將小鼠心臟放于翻拍板上用照相機(尼康D700)拍大體心臟。將拍完后的心臟脫水、石蠟包埋、切片。其中部分組織切片(n=8)留作心肌膠原天狼星紅染色；另一部分組織切片進行常規HE染色(n=8)。

結 果

1.Zileuton抑制了壓力負荷誘導的小鼠心肌重構和心功能下降:超聲結果顯示，Zileuton干預使AB-Zil組小鼠射血分數(EF)下降程度較AB-Veh組明顯緩解，并抑制了舒張末期室間隔厚度(IVSd)和左心室后壁厚度(LVPWd)的增加，同時使左心室舒張末內徑(LVDd)縮小，改善了由壓力負荷誘導的心肌重構和心功能下降(圖1，圖2)，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 各組小鼠心臟超聲影像比較

圖2 Zileuton干預對壓力負荷誘導小鼠左心室結構和心功能改變的影響與Sham-Veh組小鼠比較，*P<0.05；與AB-Veh組小鼠比較，#P<0.05；n=10

2.Zileuton改善了壓力負荷誘導的小鼠心肌細胞肥大和心肌纖維化:取材結果顯示，Zileuton干預的心肌重構模型組(AB-Zil組)小鼠心重、肺重、心重/體重比，肺重/體重比均較對照組(AB-Veh組)小鼠減輕，差異有統計學意義(P<0.05)。同時各組小鼠體重沒有明顯差異(圖3)。病理學檢測顯示，Zileuton明顯緩解了壓力負荷誘導的心肌重構，包括心肌細胞肥大和心肌纖維化(圖4)。

圖3 Zileuton干預對壓力負荷誘導小鼠心重和肺重變化的影響與Sham-Veh組小鼠比較，*P<0.05；與AB-Veh組小鼠比較，#P<0.05；n=15

圖4 病理學大體觀察以及左心室HE染色(×400)和天狼星紅染色(×200)結果與Sham-Veh組小鼠比較，*P<0.05；與AB-Veh組小鼠比較，#P<0.05；n=8

討 論

在本項研究中，筆者發現，5-LOX特異性抑制劑Zileuton能夠抑制壓力負荷誘導的小鼠心肌重構和心功能下降，包括改善射血分數，使舒張末期左心室擴大程度減少，緩解了舒張末期室間隔和左心室后壁的增厚。Zileuton對心肌重構的抑制作用通過取材結果得到進一步證實，Zileuton干預組小鼠心重、肺重、心重/體重比、肺重/體重比均較對照組小鼠減輕。心肌HE染色和天狼星紅染色也顯示Zileuton使單個心肌細胞橫截面積和心肌組織膠原沉積的增加均被抑制。

5-LOX屬于氧化還原酶，是一種含非血紅素鐵的蛋白質，其經典作用是白三烯(leukotrienes，LTs)合成的限速酶[4]。細胞膜磷脂在磷脂酶的作用下生成花生四烯酸(arachidonic acid, AA)，5-LOX催化花生四烯酸氧化生成不穩定的中間產物5-羥基二十碳四烯酸(5-hydroxyeicosate-traenoic acid，5-HETE)；隨后，5-HETE繼續在5-LOX催化下，生成 LTA4；不穩定的LTA4在LTA4水解酶作用下形成LTB4(leukotriene B4，LTB4)，在LTC4合成酶作用下形成白三烯C4(leukotriene C4，LTC4)，LTC4被主動轉運出細胞后，在α-谷氨酰轉肽酶的作用下轉化為白三烯D4(1eukotriene D4，LTD4)，LTD4再進一步代謝為白三烯E4(1eukotriene E4，LTE4)[8]。LTB4、LTC4、LTD4、LTE4均為白三烯家族成員，作為趨化因子參與免疫應答。

此外，5-LOX能夠促進活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，激活相關信號通路，加重組織氧化應激損傷，加速疾病發展[9～11]。高濃度的高金雀花堿能夠激活原代肌細胞的5-LOX，使胞內ROS產生增加，同時NADPH氧化酶表達上調，Zileuton能夠增加胞內N-乙酰半胱氨酸的生成而減少高金雀花堿誘導的ROS增加，緩解原代肌細胞損傷[12]。同時，5-LOX參與了多種疾病的組織纖維化[13, 14]。芳香烴受體的配體TCDD通過激活5-LOX增加了人原代肺纖維母細胞系HFL-1和CCL-202細胞的遷移和分化，同時成纖維細胞分化標志物α-SMA表達增加，而選擇性5-LOX抑制劑和芳香烴受體特異性拮抗劑CH223191均能夠減少HFL-1和CCL-202細胞的遷移和增殖以及α-SMA表達，從而緩解肺纖維化[15]。

Zileuton是通過抑制白三烯生成，抑制炎性及免疫信號通路，或者是通過改善心肌重構過程中過度激活的氧化應激，從而抑制心肌重構和改善心功能，目前并不清楚，需要進一步探索。但從已得到的表型數據顯示，5-LOX有可能成為抑制心肌重構、防治心力衰竭的新靶點。