肌肽納米脂質體改善人成纖維細胞抗氧化性能研究

羅 丹，洪延涵，梁 明，尹西拳，聞 慶，劉 衛,4

（1.華中科技大學 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074；2.武漢百思凱瑞生物科技有限公司，湖北 武漢 430075；3.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665；4.華中科技大學 國家納米藥物工程技術研究中心，湖北 武漢 430075）

肌肽是近年來被廣泛研究的一類天然活性肽，具有抗氧化、促進細胞能量代謝等作用[1]，肌肽還可以改善細胞正常功能，使衰老細胞年輕化[2]，因此被廣泛應用在抗衰類護膚化妝品中。納米脂質體是一種能把活性成分包封于類脂質雙分子層內的微型泡囊體，無刺激性，易降解，具有良好的靶向性、緩釋性優點[3,4]。研究表明，納米脂質體可顯著提高護膚活性成分的穩定性，促進其透皮吸收[5,6]，顯著改善護膚功效。細胞模型可以較好的評價活性物質的生理活性，采用細胞抗氧化模型評估活性物經納米脂質體包埋后的抗氧化活性變化比體外化學抗氧化更具體意義。Hu[7]認為EGCG殼聚糖多肽納米粒具有更高的細胞抗氧化活性是因為殼聚糖多肽納米粒包埋能夠顯著提高EGCG在細胞培養基中的穩定性，殼聚糖多肽納米粒能順利進入細胞內，增加活性物的抗氧化性。因此本文采用高壓勻質技術制備肌肽納米脂質體，對其理化性能和穩定性進行研究，比較了游離肌肽和肌肽納米脂質體的體外透皮性能和體外細胞水平抗氧化性能，為肌肽納米脂質體應用于抗衰老化妝品提供依據。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

肌肽，南京萊昂生物科技有限公司；大豆卵磷脂，北京美亞斯磷脂有限公司； 膽固醇，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；人成纖維細胞（HSF），昆明細胞庫；0.25%胰酶-EDTA、DMEM（高糖型）液體培養基、胎牛血清（FBS），Gibco公司；H2O2溶液，阿拉丁試劑有限公司；細胞活力檢測試劑盒（CCK-8），日本Dojindo公司；BCA蛋白定量試劑盒，碧云天生物技術公司；SOD測定試劑盒、CAT測定試劑盒、MDA測定試劑盒，南京建成生物科技有限公司；SPF級SD雄性大鼠（200～220 g），購于湖北省實驗動物研究中心（實驗動物生產許可證號：SCXK（鄂）2015-0018）。

JN-02HC高壓納米均質機，廣州聚能生物科技有限公司；Zetasizer/Nano-ZS90 納米電位粒徑分析儀，英國Malvern公司；Tecnai G220透射電子顯微鏡，荷蘭FEI公司；Agilent 1260高效液相色譜儀（HPLC），美國安捷倫公司；TK-12D透皮擴散儀，上海鍇凱科技貿易有限公司；Victor多標記分析儀，珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌肽納米脂質體的制備

稱取處方量磷脂、膽固醇于適量乙醇中，65 ℃下恒溫水浴溶解后降溫至45 ℃，磁力攪拌15 min后依次勻速加入處方量的丙二醇、甘油、肌肽和水，邊加邊攪拌，快速混勻后即得初乳。將初乳于剪切機中剪切10 min后得到微米級分散體，再于高壓均質機中120 MPa進行3次循環均質處理即得肌肽納米脂質體。

1.2.2 肌肽納米脂質體的理化性質表征

1）粒徑與Zeta電位。取適量肌肽納米脂質體，超純水稀釋一定倍數，使樣液的平均光強為150～300。用納米電位粒徑分析儀測定粒徑、多分散性系數（PDI）和Zeta電位，粒徑測定角度為 90°，測試溫度為 25 ℃。

2）載藥量與包封率。HPLC分析方法：選用Sepax HPAmino色譜柱，以乙腈與30 mmol/L磷酸氫二鉀水溶液（磷酸調pH至6.8，體積比為65∶35）為流動相進行分析， 214 nm處檢測肌肽，柱溫：30 ℃，流速：1 mL/min，進樣量：10 μL。

用超濾離心法分離納米脂質體和游離肌肽[7]。精確移取制備好的肌肽納米脂質體0.5 mL，置于超濾離心管中（截流相對分子質量為3 kD），經12 000 r/min離心30 min，收集濾液用HPLC測得游離肌肽含量，按下列公式計算包封率和載藥量。

式中，Wt為投藥量，Wf為游離肌肽含量，Wl為膜材含量。

3）微觀形貌。取肌肽納米脂質體以超純水稀釋適當倍數，取1滴置于覆有Formvar膜的銅網上，自然干燥后滴加1滴2%磷鎢酸溶液負染1～2 min，用濾紙吸干多余液體，晾干后置透射電子顯微鏡下觀察其微觀形態。

1.2.3 肌肽納米脂質體的穩定性

將制備的肌肽納米脂質體置于常溫避光、4 ℃避光、45 ℃避光和光照條件下存放，分別于30 天、60天、90天取出測定并考察其粒徑、PDI和Zeta電位的變化情況。

1.2.4 體外透皮性能測試

取一定量的肌肽原料藥和肌肽納米脂質體分別加入到空白膏霜中，攪拌混勻得到相同肌肽質量分數的原料藥霜劑和納米脂質體霜劑。參照文獻[8]采用垂直式Franz擴散池法進行離體鼠皮的透皮實驗，將完整無破損的大鼠腹部皮膚固定于接收池和供給池間，取上述霜劑各1 g于供給室中，以含有質量分數為20%丙二醇的生理鹽水為接收液，37 ℃下300 r/min攪拌。于1 ，2 ，4 ，6，8，10 ，12 h吸取接收液0.5 mL，并補充等溫空白接收液0.5 mL，HPLC檢測，計算各時間點藥物累積透過量，計算公式為：

式中，Qn為藥物累計透過量，Cn為第n次測得的藥物濃度，Ci為第i個點所測得的藥物濃度，V0為擴散池的體積即加入釋放介質的量，Vi為每次取樣的量。單位面積累計滲透量Q=Qn/S， S為擴散池的面積， 3.14 cm2。

透皮實驗結束后，取下皮膚，用超純水洗去樣品殘液后剪碎，轉入組織勻漿器中充分研磨成勻漿液，加適量接收液轉移至離心管中，7 000 r/min 離心20 min，取上清液用0.45 μm濾膜過濾后HPLC分析，計算皮膚中肌肽滯留量。

1.2.5 抗氧化功效評價

肌肽納米脂質體用DMEM培養基稀釋后，測定并考察其粒徑、PDI和Zeta電位的變化情況，脂質體穩定無聚集現象方可進行細胞實驗。

1）肌肽納米脂質體對HSF細胞增殖的影響。采用CCK-8法測定HSF細胞活力[9]，將HSF細胞用1 mL 0.25%的胰蛋白酶溶液消化3 min后加入DMEM完全培養基終止消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入DMEM完全培養基重懸細胞，再將HSF細胞接種于96孔板，細胞密度為6×103個/孔，待HSF細胞貼壁后，對照組加培養基，給藥組加入100 μL含有游離肌肽和肌肽納米脂質體的培養液，稀釋至肌肽終質量濃度分別為25，50，100，200，400 mg/L，培養24 h后每孔加入CCK-8試劑10 μL，于37 ℃、5% CO2條件下培養2 h，450 nm波長下測OD值，測定HSF細胞活力。

2）肌肽納米脂質體對H2O2誘導HSF細胞氧化損傷的影響[10]。將HSF細胞接種于96孔板，細胞密度為6×103個/孔，培養24 h后，對照組加培養基，模型組加入0.8 mmol/L的H2O2，給藥組加入0.8 mmol/L的H2O2同時加入肌肽終質量濃度分別為25，50，100，200，400 mg/L的游離肌肽和肌肽納米脂質體共培養，于37 ℃、5% CO2條件下培養24 h后用CCK-8法測定HSF細胞活力。

3）MDA、SOD、CAT生化指標的測定。將HSF細胞接種于6孔板，細胞密度為3×105個/孔，培養24 h后對照組加培養基，模型組加入0.8 mmol/L的H2O2，給藥組加入0.8 mmol/L的H2O2同時加入肌肽終質量濃度分別為50 mg/L和200 mg/L的游離肌肽和肌肽納米脂質體共培養，培養24 h后收集細胞，加入500 μL蛋白裂解液[11]，反復凍融3次將細胞裂解，12 000 r/min離心 5 min 后收集裂解產物備用，采用BCA法測定蛋白濃度。分別采用細胞丙二醛（MDA）測試盒、SOD 活性檢測試劑盒和CAT檢測試劑盒檢測細胞內MDA含量，SOD和CAT酶活力水平，具體操作步驟按照試劑盒操作說明進行。

1.2.6 數據統計與分析

數據結果采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理，所有數據均采用x±s表示，不同肌肽納米脂質體濃度處理間的差異采用one-way ANOVA進行比較分析，以P＜0.05為差異顯著，最終處理結果用origin 8.0作圖。

2 結果與討論

2.1 理化性質

肌肽納米脂質體為黃色透明澄清液體，測得其粒徑為65.5 nm，PDI為0.290，Zeta電位為-43.6 mV，測得肌肽包封率為67.0%，載藥量為6.6%。肌肽納米脂質體粒徑分布見圖1。

利用透射電子顯微鏡觀察得到肌肽納米脂質體的微觀形貌見圖2所示。由圖2可知，肌肽納米脂質體在透射電鏡下基本呈圓形，未見脂質體集聚現象，平均粒徑為60～70 nm，粒徑比較均勻。放大其中一個脂質體觀察其微觀結構，可以看到藥物溶液僅僅被一層類脂雙分子層膜包裹，為典型的單室脂質體。該種脂質體有效體積小，比多室脂質體和大的多孔脂質體更容易釋放有效包封物，并且能滲透到角質層或更深的皮層[12]。

圖2 肌肽納米脂質體透射電鏡圖Fig.2 TEM image of carnosine nanoliposome

2.2 穩定性

穩定性實驗結果見表1。在4個條件下考察90 天發現，制備得到的肌肽納米脂質體粒徑和Zeta電位變化不大；置于45 ℃、光照保存的載體PDI變大，說明該條件下儲存載體有團聚傾向，可能是貯存溫度過高，導致脂質膜流動性增加，脂質體穩定性降低，故最佳貯藏環境為避光、4 ℃保存。

表1 肌肽納米脂質體穩定性Tab.1 Stability of carnosine nanoliposome

2.3 體外透皮性能

肌肽普通霜劑及納米脂質體霜劑12 h皮膚累積透過量及皮膚滯留量的測定結果見圖3。由圖3可知，肌肽普通霜劑和肌肽納米脂質體霜劑皮膚累積透過量分別為144.83 μg/cm2和92.32 μg/cm2，皮膚滯留量分別為8.44 μg/cm2和16.08 μg/cm2。肌肽納米脂質體皮膚透過量更小，能夠將高濃度肌肽緩慢釋放，避免滲透量過高導致活性物質流失；納米脂質體滯留量更高，能有效促進肌肽在皮膚中的高濃度滯留，提高其生物利用率。

圖3 藥物體外皮膚累積透過量及滯留量Fig.3 Cu mulative permeation and retention of carnosine through/in mouse skin in vitro

2.4 體外抗氧化研究

2.4.1 對HSF細胞增殖的影響

不同質量濃度的游離肌肽和肌肽納米脂質體處理HSF細胞24 h后，細胞活力變化見圖4。由圖4可知，游離肌肽和肌肽納米脂質體添加量為25～400 mg/L時，與對照組比較，HSF細胞活力為90%～110%，說明游離肌肽和肌肽納米脂質體對HSF細胞的細胞活力無顯著影響。

圖4 游離肌肽和肌肽納米脂質體對HSF細胞增殖的影響Fig.4 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the proliferation of HSF cells

2.4.2 對H2O2誘導HSF細胞活力的影響

不同質量濃度游離肌肽和肌肽納米脂質體對H2O2誘導的HSF細胞活力影響見圖5。由圖5可知，模型組HSF細胞經0.8 mmol/L的H2O2誘導后，細胞活力降低，為63.97%；加入質量濃度為25～400 mg/L的肌肽納米脂質體后，與模型組相比，HSF細胞活力上升具有顯著性（P＜0.05）；與游離肌肽組相比，細胞活力上升具有顯著性（P＜0.05）

圖5 游離肌肽和肌肽納米脂質體對H2O2誘導HSF細胞活力的影響Fig.5 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on H2O2-induced HSF cell vitality

2.4.3 MDA、SOD、CAT生化指標的變化

MDA可引起脂質過氧化作用，進而形成過氧化物，其含量的多少直接影響機體內脂質過氧化程度，從而間接反映細胞損傷的程度[13]。游離肌肽和肌肽納米脂質體對H2O2誘導HSF細胞中MDA含量的影響見圖6。由圖6可以看出，與對照組比較，模型組HSF細胞經0.8 mmol/L的H2O2誘導后，MDA含量從對照組的1.86 nmol/L上升至5.93 nmol/L；與模型組比較，加入不同質量濃度的游離肌肽和肌肽納米脂質體均可不同程度抑制MDA含量，且具有顯著性差異（P＜0.05）。當添加量分別為50 mg/L和200 mg/L時，與游離肌肽組相比，肌肽納米脂質體的作用的HSF細胞分泌的MDA含量減少，且具有顯著性（P＜0.05），表明肌肽納米脂質體對抗脂質過氧化的作用優于游離肌肽。

圖6 游離肌肽和肌肽納米脂質體對H2O2誘導HSF細胞中MDA含量的影響Fig.6 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the MDA content in HSF cells induced by H2O2

超氧化物歧化酶（SOD）能消除生物體在新陳代謝過程中產生的有害物質，可對抗與阻斷因氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復受損細胞[14]。過氧化氫酶（CAT）是過氧化物酶體的標志酶，是催化過氧化氫分解成氧和水的酶，存在于細胞的過氧化物體內。SOD和CAT是細胞中直接的內源性抗氧化劑[15]，本文研究了肌肽納米脂質體在氧化應激條件下對細胞內抗氧化酶的影響。不同質量濃度的肌肽納米脂質體作用于H2O2誘導的HSF細胞后，對細胞內SOD和CAT活力的影響見圖7和圖8。

由圖7可以看出，與對照組相比，用0.8 mmol/L H2O2誘導HSF細胞后，模型組HSF細胞內SOD活力由294.01 U/mg降低到90.73 U/mg；與模型組比較，不同質量濃度游離肌肽和肌肽納米脂質體處理HSF后均明顯提高細胞裂解液中SOD活力，且具有顯著性差異（P＜0.05）；當肌肽質量濃度為200 mg/L時，與游離肌肽組相比，肌肽納米脂質體作用的HSF細胞SOD活力上升，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明肌肽納米脂質體提高SOD酶活的能力優于游離肌肽，更大程度降低H2O2誘導的氧化應激傷害。

由圖8可以看出，與對照組相比，用0.8 mmol/L H2O2誘導HSF細胞，模型組HSF細胞內CAT活力由23.68 U/mg降低到11.49 U/mg；與模型組比較，不同質量濃度游離肌肽和肌肽納米脂質體處理HSF后均明顯提高細胞裂解液中CAT活力，且具有顯著性差異（P＜0.05），當肌肌肽質量濃度為200 mg/L時，與游離肌肽組相比，肌肽納米脂質體的CAT活力上升，且具有顯著性差異（P＜0.05），表明肌肽納米脂質體提高CAT酶活的能力優于游離肌肽。

圖7 游離肌肽和肌肽納米脂質體對H2O2誘導HSF細胞中SOD活力的影響Fig.7 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the SOD activity in HSF cells induced by H2O2

圖8 游離肌肽和肌肽納米脂質體對H2O2誘導HSF細胞中CAT活力的影響Fig.8 Ef fects of free carnosine and carnosine nanoliposome on the CAT activity in HSF cells induced by H2O2

3 結論

本實驗所制備的肌肽納米脂質體為球形或橢圓形顆粒，包封率為67.0%，平均粒徑為65.5 nm，Zeta電位為-43.6 mV，避光低溫下儲存穩定性良好。納米脂質體能改善肌肽的透皮吸收性能，顯著增強其皮膚靶向滯留能力，相對于游離肌肽具有更好的細胞抗氧化性能。因此，肌肽納米脂質體在抗衰護膚化妝品中具有良好的應用前景。